Bacteriële peptide weergave voor de selectie van nieuwe Biotinylating enzymen
Summary
Hier presenteren we een methode om te selecteren voor nieuwe varianten van de E. coli Biotine-proteïne ligase BirA dat biotinyates een specifieke doel peptide. Het protocol beschrijft de bouw van een plasmide voor de bacteriële weergave van de doel peptide, het genereren van een BirA bibliotheek, selectie en karakterisering van BirA varianten.
Abstract
Biotine is een aantrekkelijke post-translationele modificatie van eiwitten die een krachtige tag biedt voor de isolatie en detectie van eiwitten. Enzymatische biotinylatie door de E. coli Biotine-proteïne ligase BirA is zeer specifiek en zorgt voor de biotinylatie van doel eiwitten in hun eigen omgeving; het huidige gebruik van door BirA gemedieerde biotinylatie vereist echter de aanwezigheid van een synthetische acceptor peptide (AP) in het doeleiwit. Daarom is de toepassing ervan beperkt tot eiwitten die zijn ontworpen om de AP bevatten. Het doel van dit protocol is het gebruik van de bacteriële weergave van een peptide afgeleid van een niet-gemodificeerd doeleiwit om te selecteren voor BirA-varianten die biotinyates de peptide. Het systeem is gebaseerd op één plasmide die de co-expressie van BirA-varianten mogelijk maakt, samen met een steiger voor het peptide display op het bacteriële oppervlak. Het protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor de opname van de doel peptide in de weergave-steiger, creatie van de BirA-bibliotheek, selectie van actieve BirA-varianten en initiële karakterisering van de geïsoleerde BirA-varianten. De methode biedt een zeer effectief selectiesysteem voor de isolatie van nieuwe BirA-varianten die kunnen worden gebruikt voor de verder geleide evolutie van biotine-eiwit ligasen die een inheems eiwit in complexe oplossingen biotinyeren.
Introduction
Biotinylatie van een eiwit creëert een krachtige tag voor zijn affiniteit isolatie en detectie. Enzymatische proteïne biotinylatie is een zeer specifieke post-translationele modificatie gekatalyseerd door Biotine-eiwit ligasen. De E. coli Biotine-proteïne ligase BirA is zeer specifiek en covalent biotinyaten slechts een beperkt aantal natuurlijk voorkomende eiwitten bij specifieke lysine residuen1. De voordelen van de door BirA gekatalyseerde biotinylatie worden momenteel benut door het doeleiwit te fusing met een kleine synthetische 15-aminozuur Biotine acceptor peptide (AP) die effectief biotinyleerd2 is en die de zeer specifieke en efficiënt in vivo en in vitro biotinylatie door co-expressie of toevoeging van BirA3,4,5. Hoewel de in vivo en in vitro BirA gekatalyseerde Biotine-eiwit ligatie een aantrekkelijke etiketterings strategie is, is de toepassing ervan beperkt tot monsters die AP-gesmolten eiwitten bevatten. Het doel van deze methode is de ontwikkeling van nieuwe mutanten van biotine-eiwit ligasen die selectief inheemse ongewijzigde eiwitten biotinyeren en daardoor het aantal toepassingen uitbreiden waarin de enzymatische biotinylatie strategie kan worden gebruikt.
Eiwit functie kan worden geëvolueerd door iteratieve rondes van de genmutatie, selectie en amplificatie van genvarianten met de gewenste functie. Een sterke en efficiënte selectie strategie is cruciaal voor de gerichte evolutie en biotine-eiwit ligase activiteit wordt gemakkelijk geselecteerd als gevolg van de sterke binding tussen Biotine en streptavidine en de homo logs6. Phage display technologieën maken het mogelijk om de Fagen te selecteren die biotinyleerd peptiden7,8vertonen. Omdat de versterking van geïsoleerde Fagen infectie van een bacteriële gastheer vereist, echter, de faag selectie met streptavidine creëert een knelpunt in dat de hoge-affiniteit binding van biotine streptavidine is vrijwel onomkeerbaar onder niet-denaturering Voorwaarden. Om een omkeerbare binding van biotinyleerd Fagen te garanderen, werden monomere avidins met een lagere affiniteit gebruikt, wat resulteerde in een bescheiden ~ 10-voudige verrijking7. We hebben onlangs een bacteriële weergavemethode ontwikkeld voor de isolatie van nieuwe BirA-varianten die de noodzaak van de elutie uit de affiniteits matrix elimineert en daardoor een knelpunt van de vorige BirA Selection Systems9verwijdert. Ons bacteriële display systeem zorgt immers voor een > 1, 000, 000-voudige verrijking van actieve klonen in één enkele selectie stap9, waardoor een effectief selectiesysteem wordt geboden voor de gerichte evolutie van nieuwe BirA-varianten.
Ons bacteriële display systeem bestaat uit twee componenten, BirA met een C-Terminal 6Xzijn tag en een steiger eiwit dat de oppervlakte weergave van een doel peptide mogelijk maakt. We gebruikten de steiger eiwit verbeterd circulair pergedempt buitenste membraan proteïne X (ecpx) omdat de effectieve weergave van peptiden kan worden waargenomen op zowel de N-en C-Termini10,11. De fusie van de doelpeptide sequentie tot het C-eindpunt van eCPX verzekert biotinylatie van bacteriën die actieve BirA-varianten uitdrukken. De bacteriën zorgen voor de effectieve streptavidine selectie als de biotinyleerd peptide nu op het oppervlak verschijnt (Figuur 1a).
Het doel van deze methode is om te selecteren voor nieuwe varianten van BirA dat biotinylates peptide sequenties aanwezig zijn in inheemse eiwitten. Het systeem is gecodeerd door genen die aanwezig zijn op het plasmide pBAD-BirA-eCPX-AP, dat een arabinose-oninduceerbaar promotor bevat die het BirA bestuurt (araBAD) en een T7 Promoter die eCPX9 bestuurt (Figuur 1b). Dit protocol beschrijft de gedetailleerde procedure voor 1) opname van een peptide afgeleid van een doel proteïne in de C-terminal van ecpx, 2) creatie van een mutatie Library van BirA door foutgevoelige PCR, 3) selectie van streptavidine-bindende bacteriën door magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS), 4) kwantificering van bacterie verrijking en 5) initiële karakterisering van geïsoleerde klonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals voor alle selectiemethodes, is de striktheid van de wasstappen van het allergrootste belang. Omdat bacteriën niet hoeven te worden afgeleid van de kralen vóór de versterking van de geselecteerde klonen, de hoge affiniteit binding tussen Biotine en streptavidine kan worden gebruikt in plaats van het gebruik van lagere affiniteit avidins, zoals eerder gedaan met de faag display systeem, voor de selectie van BirA-varianten7,8. Dit zorgt ervoor dat zeldzame …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Mohamed Abdullahi Ahmed voor de deskundige technicus assistentie. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Stichting Lundbeck, de Novo Nordisk Foundation, de Deense Niervereniging, de Aase og Ejnar Danielsen Foundation, de A.P. Møller Foundation voor de vooruitgang van de medische wetenschap, en Knud en Edith Eriksen Memorial Foundation.
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme’s Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
