उपन्यास Biotinylating एंजाइमों के चयन के लिए बैक्टीरियल पेप्टाइड प्रदर्शन
Summary
यहाँ हम ई कोलाई बायोटिन-प्रोटीन लिगास बीरा के उपन्यास वेरिएंट के लिए चयन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो बायोटिनलेट एक विशिष्ट लक्ष्य पेप्टाइड को पेश करता है। प्रोटोकॉल लक्ष्य पेप्टाइड के जीवाणु प्रदर्शन के लिए एक प्लाज्मिड के निर्माण का वर्णन करता है, एक BirA पुस्तकालय की पीढ़ी, चयन और BirA वेरिएंट की विशेषता.
Abstract
Biotin प्रोटीन के एक आकर्षक पोस्ट-अनुवाद संशोधन है कि अलगाव और प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली टैग प्रदान करता है. ई. कोलाई बायोटिन-प्रोटीन लिगास बीरा द्वारा एंजाइमी बायोटिनिलेशन अत्यधिक विशिष्ट है और अपने मूल वातावरण में लक्ष्य प्रोटीन के biotinylation के लिए अनुमति देता है; हालांकि, BirA मध्यस्थता biotinylation के वर्तमान उपयोग लक्ष्य प्रोटीन में एक सिंथेटिक स्वीकारकर्ता पेप्टाइड (एपी) की उपस्थिति की आवश्यकता है. इसलिए, इसके आवेदन एपी को शामिल करने के लिए इंजीनियर किया गया है कि प्रोटीन के लिए सीमित है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक असंशोधित लक्ष्य प्रोटीन से व्युत्पन्न पेप्टाइड के जीवाणु प्रदर्शन का उपयोग करने के लिए BirA वेरिएंट है कि biotinylates पेप्टाइड के लिए चयन करने के लिए है. प्रणाली एक एकल प्लाज्मिड पर आधारित है जो बैक्टीरिया की सतह पर पेप्टाइड प्रदर्शन के लिए पाड़ के साथ-साथ BirA वेरिएंट के सह-अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। प्रोटोकॉल प्रदर्शन पाड़ में लक्ष्य पेप्टाइड के समावेश के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करता है, BirA पुस्तकालय के निर्माण, सक्रिय BirA वेरिएंट का चयन और अलग BirA वेरिएंट के प्रारंभिक लक्षण. विधि उपन्यास BirA वेरिएंट है कि biotin प्रोटीन ligases के आगे निर्देशित विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि biotinylate जटिल समाधान में एक देशी प्रोटीन के अलगाव के लिए एक अत्यधिक प्रभावी चयन प्रणाली प्रदान करता है.
Introduction
एक प्रोटीन के Biotinylation अपनी आत्मीयता अलगाव और पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली टैग बनाता है. एंजाइमी प्रोटीन बायोटिनिलेशन बायोटिन प्रोटीन लिगैस द्वारा उत्प्रेरित एक अत्यधिक विशिष्ट पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है। ई. कोलाई बायोटिन प्रोटीन लिगासे बिरा अत्यंत विशिष्ट और सहसंयोजक रूप से बायोटिनलेट केवल विशिष्ट lysine अवशेषों1पर स्वाभाविक रूप से होने वाली प्रोटीन की एक प्रतिबंधित संख्या है। BirA उत्प्रेरित biotinylation के लाभ वर्तमान में एक छोटे से सिंथेटिक 15-एमिनो-एसिड बायोटिन स्वीकारकर्ता पेप्टाइड (एपी) है कि प्रभावी रूप से biotinylated2 है और अत्यधिक विशिष्ट के लिए अनुमति देता है के साथ लक्ष्य प्रोटीन fusing द्वारा उपयोग कर रहे हैं और अत्यधिक विशिष्ट और के लिए अनुमति देता है विवो में कुशल और सह-अभिव्यक्ति या बीरए 3,4,5के अलावा द्वारा इन विट्रो बायोटिनिलेशन में । हालांकि इन विवो और इन विट्रो BirA उत्प्रेरित बायोटिन प्रोटीन लिगेशन एक आकर्षक लेबलिंग रणनीति है, इसके आवेदन के नमूने है कि एपी-फ्यूजप्रोटीन होते हैं करने के लिए सीमित है। इस विधि का उद्देश्य बायोटिन प्रोटीन ligases के नए म्यूटेंट का विकास है जो चुनिंदा biotinylate देशी असंशोधित प्रोटीन और, जिससे अनुप्रयोगों की संख्या का विस्तार जिसमें एंजाइमी biotinylation रणनीति इस्तेमाल किया जा सकता है.
प्रोटीन समारोह जीन उत्परिवर्तन, चयन, और वांछित समारोह के साथ जीन वेरिएंट के प्रवर्धन के पुनरावर्ती दौर के माध्यम से विकसित किया जा सकता है. एक मजबूत और कुशल चयन रणनीति निर्देशित विकास के लिए महत्वपूर्ण है और बायोटिन प्रोटीन लिगेस गतिविधि आसानी से बायोटिन और स्ट्रेप्टाविडिन और उसके समलॉग6के बीच मजबूत बंधन के कारण चुना जाता है। फैग प्रदर्शन प्रौद्योगिकियों phages के चयन के लिए अनुमति देते हैं कि biotinylated पेप्टाइड्स7,8प्रदर्शित करते हैं . चूंकि अलग phages के प्रवर्धन के लिए एक जीवाणु मेजबान के संक्रमण की आवश्यकता होती है, हालांकि, स्ट्रेप्टाविडिन के साथ फैज चयन में एक बाधा पैदा करता है जिसमें बायोटिन के स्ट्रेपविडिन के लिए उच्च-एफ़िनिटी बाइंडिंग गैर-डेनिंग के तहत लगभग अपरिवर्तनीय है शर्तों. biotinylated phages के प्रतिवर्ती बंधन सुनिश्चित करने के लिए, कम आत्मीयता के साथ monomeric avidins का उपयोग किया गया जिसके परिणामस्वरूप एक मामूली $ 10 गुना संवर्धन7. हमने हाल ही में उपन्यास बीरा रूपों के अलगाव के लिए एक जीवाणु प्रदर्शन विधि विकसित की है जो आत्मीयता मैट्रिक्स से अधिक्युशन की आवश्यकता को समाप्त करती है और इस प्रकार पिछले बीरा चयन प्रणालियों9से एक अवरोध को दूर करती है . वास्तव में, हमारे जीवाणु प्रदर्शन प्रणाली एक एकल चयन चरण9में सक्रिय क्लोन के एक gt;1,000,000 गुना संवर्धन के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार उपन्यास BirA वेरिएंट के निर्देशित विकास के लिए एक प्रभावी चयन प्रणाली प्रदान.
हमारे जीवाणु प्रदर्शन प्रणाली दो घटकों के होते हैं, एक सी-टर्मिनल 6xHis टैग और एक पाड़ प्रोटीन है कि एक लक्ष्य पेप्टाइड की सतह प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है के साथ BirA. हम पाड़ प्रोटीन बढ़ाया परिपत्र permuted बाहरी झिल्ली प्रोटीन एक्स (eCPX) के बाद से पेप्टाइड्स के प्रभावी प्रदर्शन दोनों एन और सी termini10,11पर मनाया जा सकता है. ईसीपीएक्स के सी-टर्मिनस को टारगेट पेप्टाइड अनुक्रम का संलयन सक्रिय बीरा वेरिएंट को व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया का बायोटिनिलेशन सुनिश्चित करता है। बैक्टीरिया प्रभावी स्ट्रेप्टाविडिन चयन के लिए अनुमति देते हैं क्योंकि बायोटिनलेट पेप्टाइड अब सतह पर प्रदर्शित होता है (चित्र 1क) .
इस विधि का उद्देश्य BirA के उपन्यास वेरिएंट के लिए चयन करने के लिए है कि biotinylates पेप्टाइड दृश्यों देशी प्रोटीन में मौजूद है. इस प्रणाली को प्लाज्मिड पीबीडी-बिरा-ईसीपीएक्स-एपी पर मौजूद जीनों द्वारा एनकोडेड किया जाता है, जिसमें एक अरबन-इंसुलेबल प्रमोटर नियंत्रित बीरा (आराबैड) और एक टी 7 प्रमोटर को नियंत्रित करने वाला ईसीपीएक्स9 (चित्र 1ख) होता है। वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन 1) eCPX के सी-टर्मिनल में एक लक्ष्य प्रोटीन से व्युत्पन्न पेप्टाइड का समावेश, 2) त्रुटि-प्रवण पीसीआर द्वारा बीरा के उत्परिवर्तन पुस्तकालय का निर्माण, 3) स्ट्रेप्टाविडिन बाध्यकारी बैक्टीरिया का चयन चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (MACS), 4) बैक्टीरिया संवर्धन के परिमाणीकरण, और 5) अलग क्लोन के प्रारंभिक लक्षण.
Protocol
Representative Results
Discussion
सभी चयन विधियों के लिए के रूप में, कपड़े धोने के चरणों की कठोरता अत्यंत महत्वपूर्ण है. चूंकि बैक्टीरिया चयनित क्लोन के प्रवर्धन से पहले मोती से eluted होने की जरूरत नहीं है, biotin और streptavidin के बीच उच्च आत्मीयता बं…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों विशेषज्ञ तकनीशियन सहायता के लिए मोहम्मद अब्दुल्लाई अहमद धन्यवाद. यह काम Lundbeck फाउंडेशन, नोवो Nordisk फाउंडेशन, डेनिश किडनी एसोसिएशन, Aase ओग EZnar डैनियलसन फाउंडेशन, चिकित्सा विज्ञान की उन्नति के लिए ए.पी. मेलर फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और Knud और Edith एरिकसन मेमोरियल फाउंडेशन.
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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