Presenteras här är ett protokoll för berikande testikulär spermatocyter, runda spermatider, och vid förlängning spermatider från vuxna mus testiklarna med en diskontinuerlig bovint serum albumin densitet gradient med standard laboratorieutrustning.
För att karakterisera varje steg av spermatogenes, måste forskarna separera olika subpopulationer av könsceller från testiklarna. Att isolera diskreta populationer är dock utmanande, eftersom de vuxna testiklarna innehåller en komplex blandning av könsceller från alla steg i spermatogenes tillsammans med vissa populationer av somatiska celler. Under de senaste decennierna, olika tekniker såsom centrifugalelutriation, fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS), och STA-PUT har framgångsrikt tillämpats på isoleringen av könsceller. En nackdel är att de alla kräver dedikerade enheter och specialiserad utbildning. Följande principer som ligger till grund för sta-PUT-metoden, ett enkelt protokoll har utvecklats för isolering av testikulär spermatocyter, runda spermatider, och vid förlängning spermatider från mus testiklarna. Efter beredning av en enda cellsuspension av testikelceller, särskilda cellpopulationer berikas av gravitationen sedimentering genom en diskontinuerlig bovint serum albumin (BSA) densitet gradient. Cell fraktionerna samlas sedan in manuellt och analyseras mikroskopiskt. Denna modifierade densitet gradient för runda spermatider (Mdr) sedimentering protokollet kan tillämpas i stor utsträckning, eftersom det kräver endast standard laboratorieutrustning. Dessutom kräver protokollet minimala utgångsmaterial, vilket minskar dess kostnader och användning av försöksdjur.
Mycket är fortfarande okänt om de molekylära och biologiska händelser som äger rum under däggdjurs spermatogenes, en komplicerad process där spermatogoniala stamceller förvandlas till högspecialiserade spermatozoer1,2. Spermatogenes sker inuti sädeskanalerna av testiklarna. Tubuli innehåller en blandning av könsceller från varje steg av differentiering, inklusive spermatogoniala stamceller, mitotiskt dividera spermatogonia, meiotiska spermatocyter, och postmeiotiska spermatider (som genomgår haploida differentiering från runda spermatider till vid förlängning spermatider, och slutligen till mogna spermatozoa). Somatiska celler av testiklarna inkluderar Sertoli celler som blandas med könsceller inne i seminiska tubuli, peritubulär myoid celler som bildar väggarna i tubuli, och testosteron-producerande Leydig celler i interstitiell utrymme mellan tubuli.
Att studera molekylära och biokemiska processer under spermatogenes kräver ofta separation av distinkta köns cells populationer från en komplex blandning av testikelceller. Många olika strategier har utvecklats för cell berikning. De mest framgångsrika metoderna är sta-put Velocity sedimentering av enheten allvar3,4,5,6, centrifugal elutriation baserad på motströms centrifugering7,8, och fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) som separerar celler i enlighet med DNA-innehåll och/eller specifika markörer. Dessa metoder används ofta bland forskare spermatogenes och möjliggöra en effektiv berikning av specifika bakteriecell typer. Men en begränsning av dessa tekniker är att de kräver specialiserad, dyr hårdvara som kräver expertis.
Presenteras här är ett enkelt och billigt protokoll för att isolera berikade populationer av de tre vanligast förekommande cellpopulationer av mus testiklarna: runda spermatids, testikulär spermatocyter, och vid förlängning spermatids. Detta protokoll kallas den modifierade densitetsgradienten för runda spermatider (Mdr), eftersom det fungerar särskilt bra för berikande runda spermatider. MDR-metoden bygger på samma principer som STA-PUT Velocity sedimentation, men det kräver bara standard laboratorieutrustning. Levande celler tillåts sediment genom en manuellt beredd diskontinuerlig bovint serum albumin (BSA) densitet gradient inuti en standard 50 mL rör under jordens gravitationsfält. Större celler rör sig snabbare genom gradienten, som separerar olika populationer av könsceller. Efter sedimentation, anrikad fraktioner av de tre celltyper samlas in manuellt. Renheten hos dessa anrikade cellpopulationer är jämförbar med de som erhålls genom STA-PUT och centrifugal elutriation.
Förutom att täcka konstruktionen och användningen av BSA-gradienten för hastighets sedimentering, beskriver protokollet också en digestionsmetod för att frigöra testikelceller från seminihaltiga tubuli. Protokollet ändrades från det som utvecklades av Romrell et al.9 och omfattar sekventiella digestioner med kollagenas IV och trypsin. Sekventiella digestioner kombinerat med användning av en bikarbonatbuffert (dvs. Krebs-lösningen) har visat sig kraftigt öka separationen och livskraften hos könscellerna9.
Under MDR berikning, celler spenderar runt 4 h tillsammans utanför miljön i seminiösa tubuli och utsätts inte för stressande mekaniska krafter, vilket möjliggör insamling av mycket livskraftiga cellulära fraktioner för nedströms analys. Dessutom, liknande den centrifugal elutriation och STA-PUT, MDR-protokollet inte kräver någon kemisk behandling eller märkning av celler, vilket också bidrar till att bibehålla sin lönsamhet. Viktigare, så lite som två vuxna mus testiklarna är tillräckliga för MDR isolering och därför, en vuxen mus ger tillräckligt berikade celler för både RNA och proteinanalys. Standard STA-PUT-protokollet rekommenderar användning av så många som 12 vuxna möss för cell isolering6; även om, baserat på tidigare erfarenhet, är det känt att framgångsrik isolering kan göras från tre till fyra vuxna möss. Den lägsta mängden utgångsmaterial rapporteras vara tillräcklig för centrifugal elutriation är sex mus testiklarna (tre möss)8. Därför, förutom att eliminera behovet av dyr specialiserad utrustning, MDR-protokollet minskar antalet försöksdjur som krävs.
Presenteras här är ett enkelt och billigt protokoll för att isolera anrikade populationer av runda spermatider, testikulär spermatocyter, och vid förlängning spermatider med hjälp av standard laboratorieutrustning (översikt av protokollet som visas i figur 4). Även om ingen expertis eller dyr maskin krävs, det finns några kritiska steg som måste beaktas vid vävnadsnedbrytning, byggandet av gradienten, och lastning av cellsuspensionen på gradienten.
Könsceller frigörs från seminihaltiga tubuli av två på varandra följande enzymatiska digestions. Den första matsmältningen med kollagenas från IV separerar seminihaltiga tubuli genom att ta bort interstitiella celler. Långvarig digestionstid kan skada tubuli och leda till förlust av spermatider, som (om frigörs från tubuli under detta steg) de kommer att kasseras i följande steg. Den andra digestionssteget med trypsin frigör könsceller från seminihaltiga tubuli. Det kan finnas enstaka cell Lys och typiskt några klumpar form på grund av utsläppt genomisk DNA. Överskrider den föreslagna varaktigheten eller temperaturen av matsmältningen rekommenderas inte, eftersom detta kan leda till sämre lönsamhet, ökad cell Lys, och klumpar. Om mild klumpar inträffar, kan klumpar ignoreras. Emellertid, i fall av betydande klumpar och förlust av celler, trypsin digestionstid eller koncentration bör minskas. Det bör också noteras att trypsins enzymatiska aktivitet kan variera mellan partier och under långa lagringstider. Mängden DNase jag under trypsin matsmältningen kan också ökas för att ta bort överskott klumpar, men detta bör betraktas som en sekundär lösning. Det är viktigt att få en homogen encellig suspension i slutet av förbehandlingen, eftersom klumpgranulat celler kommer sediment snabbare, kontaminerar fraktioner och störa gradienten.
Att bygga gradienten kan kräva lite övning. Om det finns obehag med en 5 mL pipett spets med en pipett Controller, det rekommenderas att använda en normal 1 mL mekanisk pipett med en slät kolv sedan skära pipetten spetsar till en bländare på ~ 3 mm i diameter (figur 1B). En bredare bländare och smidig lastning av BSA-lösningarna minskar risken för att lutningen blandas. Vid korrekt förberedd, är det möjligt att se gränserna mellan intilliggande BSA lösningar på grund av deras olika brytningsindex. Lutningen ska framställas direkt före användning. Det bör också noteras att eventuella små skakningar eller vibrationer kan störa lutningen, så lutningen bör ställas in i en miljö där det inte kommer att störas.
Lastning av cellsuspensionen på gradienten måste göras mycket noggrant. Efter lastning bör cellsuspensionen stanna på toppen av gradienten, från vilken cellerna sakta kommer att börja sediment genom det första lagret. Om stora grupper av celler ses rör sig snabbt genom gradienten, cellerna var sannolikt inte återsuspenderas försiktigt eller det finns överskott klumpar. Om cellerna inte stannar på toppen av den diskontinuerliga BSA-gradienten vid lastning men omedelbart sjunker mellan 1% och 2% BSA-lager (steg 3,6), är cellsuspensionen sannolikt alltför tät. Detta protokoll har optimerats med hjälp av två testiklarna av en vuxen mus (80-120 mg/testis) som utgångsmaterial; även om framgångsrika isoleringar med reducerade mängder av utgångsmaterial har utförts. För att Uppskala protokollet och få mer berikade könsceller från högre antal testiklarna, bör mer 50 mL rör med gradienten införas.
Protokollet utvecklades ursprungligen och optimerad för att berika haploida runda spermatider från vuxna mus testiklarna, och renhet runda spermatid fraktioner förväntas vara mer än 90%. Förutom mycket ren runda spermatid fraktioner, tillfredsställande resultat för berikning av testikulär spermatocyter och vid förlängning spermatider erhölls. Det bör noteras att erytrocyter kan förora den förlängda spermatid fraktioner, och ytterligare åtgärder för att eliminera dem bör tas om deras närvaro förväntas störa nedströms analyser. Vi har inte kunnat berika andra celltyper såsom premeiotiska eller tidiga meiotiska celler (före testikulär fas) från vuxna möss med hjälp av Mdr-protokollet.
Dessutom, sta-put sedimentering har framgångsrikt använts för att få berikade fraktioner av spermatogonier eller preleptotene, leptotene, och zygotene spermatocyter med juvenila testiklarna samlas vid givna tidpunkter efter födseln13. Denna metod utnyttjar utseendet på dessa celltyper under den första vågen av spermatogenes. Samma tillvägagångssätt kan sannolikt tillämpas på MDR-berikning, men det har ännu inte testats i praktiken. En annan metod som är ett bra alternativ för rening av premeiotiska och meiotiska metafaserna celler vid specifika stadier av differentiering är FACS, som har den viktiga fördelen att tillåta isolering av specifika celler typer baserat på närvaron specifika markörer14 ,15,16,17.
Sammantaget fungerar MDR-hastighetssedimenteringen som en användbar metod för att berika könsceller. Även om denna metod inte är överlägsen andra väletablerade metoder i termer av renhet eller kvantitet av berikade celler, dess tydliga fördelar är dess enkelhet och låga uppsättningskostnader. Detta, tillsammans med den låga mängden nödvändiga utgångsmaterial, göra detta protokoll ett bra alternativ för forskare i spermatogenes fältet och de inom andra områden som kanske inte vill investera i specialiserad hårdvara eller stora grupper av djur.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka alla medlemmar i Kotaja Lab för deras bidrag under utvecklingen av protokollet, och den aktiva användningen och testningen av protokollet i deras forskningsprojekt. I synnerhet uppskattar vi bidraget från Jan Lindström för hjälp med att optimera protokollet. Studien stöddes av Finlands Akademi, Sigrid Jusélius stiftelse och Åbo doktorandprogram för molekylär medicin.
4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
Dextrose | Preference of researcher | ||
DNase I | Worthington | LS006355 | |
GAPDH | HyTest | 5G4 | |
HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
KCl | Preference of researcher | ||
KH2PO4 | Preference of researcher | ||
MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
NaCl | Preference of researcher | ||
NaHCO3 | Preference of researcher | ||
NH4Cl | Preference of researcher | ||
Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
Trypsin | Worthington | LS003703 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1.5 mL or 2 ml tubes | Preference of researcher | ||
40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
cell culture incubator | Preference of researcher | ||
centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
microdissection scissors | Preference of researcher | ||
microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
tips for 1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
water bath | Preference of researcher | ||
widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |