אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

Summary

ההשפעות של מעכבי migrastatic על הגירה התאים של סרטן glioma בתלת מימדי (3D) הפלישה אומר באמצעות המעכב deacetylase (HDAC) מתאפיין במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.

Abstract

גילוי ופיתוח של תרופות בחקר הסרטן הוא יותר ויותר מבוסס על מסכי הסמים בפורמט 3D. מעכבי הרומן מיקוד הפוטנציאל הנדידה פולשנית של תאים סרטניים, וכתוצאה מכך התפשטות גרורתית של המחלה, מתגלים ונחשבים טיפולים משלימים סרטן פולשני מאוד כגון gliomas. לכן, יצירת נתונים המאפשרים ניתוחים מפורטים של תאים בסביבה תלת-ממדית לאחר הוספת תרופה נדרשת. המתודולוגיה מתוארת כאן, שילוב של הפלישה ספרואיד מספר עם לכידת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח נתונים על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ (CLSM), מאפשר אפיון מפורט של ההשפעות של מעכבי נגד נדידה הפוטנציאלי MI-192 על תאים glioma. Spheroids נוצרו קווי התא עבור בחני פלישה אומר ב מחסיד נמוך 96-טוב צלחות ולאחר מכן מוכן ניתוח clsm. זרימת העבודה המתוארת הייתה מועדפת על-ידי שימוש נפוץ אחרים ביצירת שיטות הייצור הנפוצות בשל הקלות והתוכסות. זה, בשילוב עם רזולוציית תמונה משופרת מושגת על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לעומת גישות רגילות שדה רחב, איפשר זיהוי וניתוח של שינויים מורפולוגיים ברורים בתאי נדידה בסביבה תלת-ממדית לאחר טיפול עם התרופה migrastatic MI-192.

Introduction

שלוש טכנולוגיות ספרואיד ממדיות לגילוי תרופות טרום-קליניות ופיתוח תרופות לסרטן פוטנציאליות הן יותר ויותר להיות המועדף על מסכי סמים קונבנציונליים; כך, יש יותר פיתוח של migrastatic-הגירה ומניעת פלישה-סמים. הרציונל מאחורי ההתפתחויות האלה בטיפול בסרטן הם ברורים: 3d ספרואיד בחני מייצגים גישה מציאותית יותר לסינון תרופות נגד סרטן פוטנציאלי כפי שהם מחקים אדריכלות הגידול 3d בנאמנות יותר מאשר התרבויות התא דופלקס, באופן מדויק יותר, ולאפשר אפיון של פעילות התרופות בהגדרה הקשורה לגידול. בנוסף, עליית ההתנגדות לתרופות כימוחלות בסוגים רבים של סרטן ושיעורי מוות גבוה בקרב חולי סרטן בשל הפוטנציאל גרורות על ידי היכולת של תאים סרטניים להגר לאתרי גידול מרחוק תומך הכללה של סוכני כימותרפיות מיקוד הפוטנציאל הנדידה של תאים סרטניים כמו הטיפול שדון בעתיד סרטן קליני ניסויים¹. זה במיוחד המקרה של סרטן פולשני מאוד, כגון glioblastomas בדרגה גבוהה (GBM). ניהול GBM כולל ניתוח, הקרנות, וכימותרפיה. עם זאת, גם עם טיפול משולב, רוב המטופלים מתדרדרות בתוך שנה 1 של אבחנה ראשונית עם הישרדות חציון של 11-15 חודשים^2,3. התקדמות אדירה בתחום הטכנולוגיה 3D נעשו בשנים האחרונות: מערכות מיקרו, מבנים מפוברק ו 3D פיגומים, ומוסר הפרט השני הם השתפרו ללא הרף כדי לאפשר בדיקות שגרתיות בקנה מידה גדול^{4, 5,6,7}. עם זאת, התוצאות שהתקבלו משיטות אלה חייבות להיות מנותח באופן משמעותי משום שפענוח הנתונים מפריע לעתים קרובות על-ידי ניסיונות לנתח נתונים שנוצרו על-ידי 3D עם מערכות ניתוח תמונה דו-ממדית.

למרות היותו עדיף במונחים של מהירות רכישת תמונה והפחתת רעילות התמונה, רוב מערכות השדה הרחב נשארות מוגבלות על ידי רזולוציה⁸. לפיכך, מלבד מידע לקריאה הקשורות ליעילות הסמים, השפעות מפורטות של פעולת התרופה על מבנים סלולריים תלת-ממדיים של תאים הגירה יאבדו באופן בלתי נמנע אם התמונה באמצעות מערכת שטח רחב. לעומת זאת, מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד (clsm) לוכדת באיכות גבוהה, תמונות מנות בצורה אופטית שניתן לשחזור ומעובד ב-3d לאחר הרכישה באמצעות תוכנת מחשב. כך, CLSM ישימה בקלות על הדמיה מורכבים 3D מבנים סלולריים, ובכך מאפשר חקירה של ההשפעות של מעכבי anti-migrastatic על מבנים תלת-ממד וניתוחים מעמיק של מנגנוני הגירה התא. זה ללא ספק ידריך בעתיד migrastatic התפתחות התרופה. כאן, מתוארת זרימת עבודה משולבת של דור כדורי, טיפול בתרופות, כתמים ואפיון על-ידי מיקרוסקופ קונטואיד ברזולוציה גבוהה.

Protocol

1. הדור של הספרואידים תא היום הראשון הכן את מדיום התרבות הסטנדרטית כנדרש על-ידי קו התא תחת חקירה. בצע את כל תרבות הרקמה הקשורים שלבים במכסה של תרבות הרקמה באמצעות טכניקות טיפול סטרילי. טריזיסיזציה וספירת תאים סרטניים. השתמש ב-20 מ ל של השעיית תאים לכל ?…

Representative Results

טכנולוגיית ספרואיד תלת ממדית מקדמת את ההבנה של אינטראקציות הגידול בסמים, משום שהיא מייצגת יותר את הסביבה הספציפית לסרטן. הדור של הספרואידים יכול להיות מושגת במספר דרכים; הדבקות נמוכה 96-לוחיות הרישוי שימשו בפרוטוקול זה. לאחר בדיקת מספר מוצרים מיצרנים שונים, הצלחות המשמשו…

Discussion

הדרך הרומן ליצור spheroids תאים סרטניים לזיהוי של פעילות סמים migrastatic באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ברזולוציה גבוהה מתואר. השימוש בלוחות מסוכרנים נמוכים על פני טכניקות אחרות, כגון תליית טיפות¹⁵, הקלה על אמצעי ליצירת הספרואידים ומדים אחידים לשימוש הגירה קולגן הפלישה assays. הנקודות …

Materials

Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various – according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3ml)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
various multichannel (50 – 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.