Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato
Summary
Aqui, descrevemos um método para entregar drogas ao sistema nervoso central do rato implantando um cateter no espaço intrathecal lombar da espinha. Nós nos concentramos na entrega de oligonucleotídeos antisenso, embora este método seja adequado para a entrega de outras modalidades terapêuticas também.
Abstract
A barreira hematola (BBB) é uma defesa importante contra a entrada de agentes potencialmente tóxicos ou patogênicos do sangue para o sistema nervoso central (SNC). No entanto, sua existência também reduz drasticamente a acessibilidade dos agentes terapêuticos administrados sistemicamente ao SNC. Um método para superar isso, é injetar esses agentes diretamente no líquido cefalorraquidiano (CSF), ignorando assim o BBB. Isso pode ser feito através da implantação de um cateter para infusão contínua usando uma bomba osmótica, ou para entrega única bolus. Neste artigo, descrevemos um protocolo cirúrgico para a entrega de oligonucleotídeos antisenso (ASOs) através de um cateter implantado diretamente no espaço cauda equina da coluna de ratos adulta. Como resultados representativos, mostramos a eficácia de uma única injeção intrathecal (TI) de ASO através deste sistema de cateterismo em derrubar o RNA alvo em diferentes regiões do CNS de ratos. O procedimento é seguro, eficaz e não requer equipamentos caros ou ferramentas cirúrgicas. A técnica descrita aqui pode ser adaptada para entregar drogas em outras modalidades também.
Introduction
O sistema vascular do sistema nervoso central (SNC) evoluiu como um regulador crítico da homeostase, controlando o tráfego de moléculas, fornecendo nutrientes e livrando-se do desperdício. Este sistema é também a primeira linha de defesa de ataques de patógenos externos, graças a uma densa distribuição de junções apertadas ao longo das paredes das células endotélias. Estas junções apertadas compõem um aspecto da barreira cerebral do sangue (BBB). Enquanto o BBB permite o transporte de moléculas necessárias para atender demandas de nutrientes e energia (por exemplo, íons, glicose), também limita seletivamente a passagem de patógenos, bem como produtos químicos tóxicos1,2,3.
Ironicamente, a mesma função protetora do BBB que limita a passagem de patógenos e produtos químicos tóxicos também é o principal obstáculo à nossa capacidade de acessar facilmente o SNC com tratamentos terapêuticos após a administração sistêmica para o organismo2, 4,5. Esse papel do BBB levou ao desenvolvimento de uma infinidade de novas tecnologias de distribuição de medicamentos e abordagens6.
Uma maneira de superar esse obstáculo é injetar as drogas diretamente no líquido cefalorraquidiano (CSF) que continuamente perfunde tanto o cérebro quanto a medula espinhal7,8,9,10. Neste artigo, descrevemos um método para entregar com sucesso os agentes para o espaço intratelal lombar, colocando a extremidade interna do cateter completamente no espaço cauda equina da coluna vertebral do rato. Uma descrição deste procedimento foi publicada previamente por Mazur et al. em outra parte11.
O protocolo é muito eficaz e produz uma taxa de sucesso superior a 90% de entrega de oligonucleotídeos antisenso (ASO) ao SNC quando avaliada pela análise quantitativa de reação em cadeia de polimerase (qPCR) do knockdown de genes-alvo8. O procedimento causa desconforto mínimo para os animais, já que 100% dos ratos sobrevivem à cirurgia e mostram inchaço mínimo em torno da ferida cirúrgica e sem sinais de angústia (por exemplo, hiperatividade, desidratação, circulando, perda de equilíbrio, diminuição da ingestão de alimentos e desidratação) durante a observação pós-operatório. Outra vantagem do método descrito aqui é que ele não requer equipamentos caros, nem quaisquer ferramentas especiais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O artigo atual mostra um método poderoso para entregar agentes terapêuticos diretamente no CNS do rato. Em teoria, uma técnica semelhante também pode ser realizada em camundongos, embora devido ao tamanho menor, o método pode ser mais desafiador. Portanto, nosso grupo realiza injeções intracerebroventriculares (ICV) em camundongos para entrega de medicamentos do SNC, que atingem os mesmos objetivos por meio de uma rota de administração diferente. Esse método foi descrito em outro estudo16</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à Ionis Pharmaceuticals por fornecer os ASOs descritos no artigo.
Materials
| 3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture | 3M | 1020 | ||
| 70% ethanol | Decon Laboratories, Inc | 8416-160Z | ||
| Alcohol swab sticks | Dynarex | NO 1204 | ||
| BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip | BD | 1ml TB Luer-Lok tip | BD 302830 | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in | BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P) | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in | BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B) | |
| BD Intramedic PE Tubing Adapters | BD | 23 gauge intramedic luer stub adaper | BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E | 120V 1.2A |
| BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G | BD | BD 305128 | ||
| Buprenorphine Sustained Release-lab | ZooPharm | Prescription required | ||
| Ethylene oxide sterilizer | Andersen Sterilizer INC. | AN 74i, gas sterilizer | AN 74i | |
| Guide cannula | BD | 19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle | BD 305186 | |
| Hamilton syringe 100ul | Hamilton company | Hamilton syringe 100ul | ||
| Hot bead Sterilizer | Fine Science Tools | STERILIZER MODELNO FST 250 | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra veterranery product | 17033-211-38 | ||
| Pocket Pro Pet Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9931 B | ||
| Povidone scrub | PDI | S48050 | ||
| Saline | Baxter | Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml | FE1306G | |
| Scalpel | Feather | disposable scalpel | No. 10 | |
| Small animal heating pad | K&H Manufacturing | Model # 1060 | ||
| Stylet Wire | McMaster-Carr | 1749T14 | LH-36233780 | |
| Surgery Towel drape | Dynarex | 4410 | ||
| Surgical scissors and forceps | FST and Fisher Scientific | |||
| Sutures | Ethicon | 4-0 or 5-0 | ||
| Tool to make the Guide cannular | Grainger | Rotary tool (Dremel) | 14H446 (Mfr: EZ456) | 1.5” diameter, Pk5 |
| EZ lock cut off Wheel | 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24) | 1.5”, Pk2 | ||
| Grinding Wheel, Aluminum Oxide | 38EY44 (Mfr: EZ541GR) | |||
| EZ lock Mandrel | 1PKX8 (Mfr: EZ402-01) | 1.5” diameter | ||
| Diamond wheel floor Tile | 3DRN4 (Mfr: EZ545) | |||
| Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure | ||||
| Dosing catheter system | SAI Infusion Systems | RIDC-01 | ||
| Guide cannula | SAI Infusion Systems | RIDC-GCA | ||
| Internal Catheters | SAI Infusion Systems | RIDC-INC | ||
| Stylet Wire | SAI Infusion Systems | RIDC-STY |
References
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