Внутритековая доставка антисмысловых олигонуклеотидов в центральной нервной системе Крысы
Summary
Здесь мы описываем метод доставки лекарств в центральную нервную систему крыс путем имплантации катетера в поясничное внутричебное пространство позвоночника. Мы ориентируемся на доставку антисмысловых олигонуклеотидов, хотя этот метод подходит и для доставки других терапевтических способов.
Abstract
Гематоэнцефалический барьер (BBB) является важной защитой от входа потенциально токсичных или патогенных агентов из крови в центральную нервную систему (ЦНС). Однако его существование также значительно снижает доступность системно управляемых терапевтических агентов для ЦНС. Один из способов преодоления этого, заключается в том, чтобы вводить эти агенты непосредственно в спинномозговой жидкости (CSF), таким образом, в обход BBB. Это может быть сделано путем имплантации катетера либо для непрерывного вливания с помощью осмотического насоса, или для одной доставки болюса. В этой статье мы описываем хирургический протокол для доставки CNS-таргетинга антисмысловых олигонуклеотидов (ASOs) через катетер имплантированных непосредственно в cauda equina пространство взрослого позвоночника крысы. В качестве репрезентативного результата мы показываем эффективность одной инъекции болюса ASO внутритековой (ИТ) через эту систему катетеризации в сбивании целевой РНК в различных регионах крысы ЦНС. Процедура безопасна, эффективна и не требует дорогостоящего оборудования или хирургических инструментов. Описанный здесь метод может быть адаптирован для доставки наркотиков в других условиях.
Introduction
Сосудистая система центральной нервной системы (ЦНС) превратилась в критический регулятор гомеостаза, контролирующий движение молекул, снабжающий питательными веществами и избавляющийся от отходов. Эта система также является первой линией защиты от атак внешних патогенов, благодаря плотному распределению плотных узлов вдоль стен эндотелиальных клеток. Эти плотные соединения составляют один аспект гематоэнцефалического барьера (BBB). В то время как BBB позволяет транспортировать молекулы, необходимые для удовлетворения потребностей в питательных веществах и энергии (например, ионы, глюкоза), он также избирательно ограничивает прохождение патогенных микроорганизмов, а также токсичных химических веществ1,2,3.
По иронии судьбы, та же защитная функция BBB, что ограничивает прохождение патогенных микроорганизмов и токсичных химических веществ также является основным препятствием для нашей способности легко получить доступ к ЦНС с терапевтическим лечением после системного введения в организм2, 4,5. Эта роль BBB побудила развитие множества новых технологий распределения наркотиков и подходов6.
Один из способов преодолеть это препятствие заключается в том, чтобы вводить наркотики непосредственно в спинномозговой жидкости (CSF), которая постоянно пронизывает как головной и спинной мозг7,8,9,10. В этой статье мы описываем метод успешной доставки агентов в пояснично-поясничное внутреннее пространство, поместив внутренний конец катетера полностью в cauda equina пространстве крысиного позвоночника. Описание этой процедуры было ранее опубликовано Mazur et al. в другом месте11.
Протокол является очень эффективным и производит более 90% успеха антисмысловых олигонуклеотидов (ASO) доставки в ЦНС при оценке количественной полимеразы цепной реакции (qPCR) анализ целевого гена нокдаун8. Процедура вызывает минимальный дискомфорт для животных, так как 100% крыс выживают в хирургии и показывают минимальный отек вокруг хирургической раны и никаких признаков бедствия (например, гиперактивность, обезвоживание, кружение, потеря равновесия, снижение приема пищи, и обезвоживание) во время послеоперационного наблюдения. Еще одним преимуществом описанного здесь метода является то, что он не требует ни дорогостоящего оборудования, ни каких-либо специальных инструментов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящей статье показан мощный метод доставки терапевтических агентов непосредственно в крысу ЦНС. В теории, аналогичный метод может быть выполнена и у мышей, хотя из-за меньшего размера, метод может быть более сложным. Таким образом, наша группа выполняет инъекции инtracerebroventricular (ICV) ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Ionis Pharmaceuticals за поставку АСО, описанных в статье.
Materials
| 3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture | 3M | 1020 | ||
| 70% ethanol | Decon Laboratories, Inc | 8416-160Z | ||
| Alcohol swab sticks | Dynarex | NO 1204 | ||
| BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip | BD | 1ml TB Luer-Lok tip | BD 302830 | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in | BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P) | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in | BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B) | |
| BD Intramedic PE Tubing Adapters | BD | 23 gauge intramedic luer stub adaper | BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E | 120V 1.2A |
| BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G | BD | BD 305128 | ||
| Buprenorphine Sustained Release-lab | ZooPharm | Prescription required | ||
| Ethylene oxide sterilizer | Andersen Sterilizer INC. | AN 74i, gas sterilizer | AN 74i | |
| Guide cannula | BD | 19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle | BD 305186 | |
| Hamilton syringe 100ul | Hamilton company | Hamilton syringe 100ul | ||
| Hot bead Sterilizer | Fine Science Tools | STERILIZER MODELNO FST 250 | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra veterranery product | 17033-211-38 | ||
| Pocket Pro Pet Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9931 B | ||
| Povidone scrub | PDI | S48050 | ||
| Saline | Baxter | Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml | FE1306G | |
| Scalpel | Feather | disposable scalpel | No. 10 | |
| Small animal heating pad | K&H Manufacturing | Model # 1060 | ||
| Stylet Wire | McMaster-Carr | 1749T14 | LH-36233780 | |
| Surgery Towel drape | Dynarex | 4410 | ||
| Surgical scissors and forceps | FST and Fisher Scientific | |||
| Sutures | Ethicon | 4-0 or 5-0 | ||
| Tool to make the Guide cannular | Grainger | Rotary tool (Dremel) | 14H446 (Mfr: EZ456) | 1.5” diameter, Pk5 |
| EZ lock cut off Wheel | 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24) | 1.5”, Pk2 | ||
| Grinding Wheel, Aluminum Oxide | 38EY44 (Mfr: EZ541GR) | |||
| EZ lock Mandrel | 1PKX8 (Mfr: EZ402-01) | 1.5” diameter | ||
| Diamond wheel floor Tile | 3DRN4 (Mfr: EZ545) | |||
| Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure | ||||
| Dosing catheter system | SAI Infusion Systems | RIDC-01 | ||
| Guide cannula | SAI Infusion Systems | RIDC-GCA | ||
| Internal Catheters | SAI Infusion Systems | RIDC-INC | ||
| Stylet Wire | SAI Infusion Systems | RIDC-STY |
References
- Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
- Greene, C., Campbell, M. Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules. Tissue Barriers. 4 (1), e1138017 (2016).
- Daneman, R., Engelhardt, B. Brain barriers in health and disease. Neurobiology of Disease. 107, 1-3 (2017).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Research Reviews. 64 (2), 328-363 (2010).
- Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. E. Recent advances in delivery through the blood-brain barrier. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (9), 1148-1160 (2014).
- Brinker, T., Stopa, E., Morrison, J., Klinge, P. A new look at cerebrospinal fluid circulation. Fluids Barriers CNS. 11, 10 (2014).
- Standifer, K. M., Chien, C. C., Wahlestedt, C., Brown, G. P., Pasternak, G. W. Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor. Neuron. 12 (4), 805-810 (1994).
- Wahlestedt, C., et al. Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions. Nature. 363 (6426), 260-263 (1993).
- Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides. Science. 259 (5094), 528-531 (1993).
- Mazur, C., et al. Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).
- Wolf, D. A., et al. Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (2), e85311 (2016).
- Becker, L. A., et al. Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice. Nature. 544 (7650), 367-371 (2017).
- Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions. RNA Biology. 14 (12), 1705-1714 (2017).
- Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. RNA-Targeted Therapeutics. Cell Metabolism. 27 (4), 714-739 (2018).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3558-3567 (2018).
- Schoch, K. M., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases. Neuron. 94 (6), 1056-1070 (2017).
- Lane, R. M., et al. Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington’s Disease. Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).
- Wurster, C. D., Ludolph, A. C. Antisense oligonucleotides in neurological disorders. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).
- Haché, M., et al. Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience. Journal of Child Neurology. 31 (7), 899-906 (2016).
- Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy. Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).
- Wurster, C. D., Ludolph, A. C. Nusinersen for spinal muscular atrophy. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).
