Entrega intratecal de oligonucleótidos antisentido en el sistema nervioso central de Rata
Summary
Aquí, describimos un método para suministrar medicamentos al sistema nervioso central de la rata mediante la implantación de un catéter en el espacio intratecal lumbar de la columna vertebral. Nos centramos en la entrega de oligonucleótidos antisentido, aunque este método es adecuado para la entrega de otras modalidades terapéuticas también.
Abstract
La barrera hematoencefálica (BBB) es una defensa importante contra la entrada de agentes potencialmente tóxicos o patógenos de la sangre en el sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, su existencia también reduce drásticamente la accesibilidad de los agentes terapéuticos administrados sistémicamente al SNC. Un método para superar esto, es inyectar esos agentes directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR), evitando así el BBB. Esto se puede hacer a través de la implantación de un catéter para perfusión continua utilizando una bomba osmótica, o para la administración de bolo único. En este artículo, describimos un protocolo quirúrgico para la entrega de oligonucleótidos antisentidos dirigidos al SNC (ASO) a través de un catéter implantado directamente en el espacio de cauda equina de la columna adulta de rata. Como resultados representativos, mostramos la eficacia de una única inyección intratecal de ASO de bolo a través de este sistema de cateterismo para derribar el ARN objetivo en diferentes regiones del SNC de rata. El procedimiento es seguro, eficaz y no requiere costosos equipos o herramientas quirúrgicas. La técnica descrita aquí también se puede adaptar para suministrar medicamentos en otras modalidades.
Introduction
El sistema vascular del sistema nervioso central (SNC) ha evolucionado como un regulador crítico de la homeostasis, controlando el tráfico de moléculas, suministrando nutrientes y eliminando los residuos. Este sistema es también la primera línea de defensa de los ataques de patógenos externos, gracias a una densa distribución de uniones estrechas a lo largo de las paredes de las células endoteliales. Estas uniones estrechas conforman un aspecto de la barrera hematoencefálica (BBB). Mientras que el BBB permite el transporte de moléculas necesarias para satisfacer las demandas de nutrientes y energía (por ejemplo, iones, glucosa), también limita selectivamente el paso de patógenos, así como sustancias químicas tóxicas1,2,3.
Irónicamente, la misma función protectora del BBB que limita el paso de patógenos y sustancias químicas tóxicas también es el principal obstáculo para nuestra capacidad de acceder fácilmente al SNC con tratamientos terapéuticos después de la administración sistémica al organismo2, 4,5. Este papel del BBB ha impulsado el desarrollo de una plétora de nuevas tecnologías y enfoques de distribución de medicamentos6.
Una forma de superar este obstáculo es inyectar los fármacos directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) que persigue continuamente tanto el cerebro como la médula espinal7,8,9,10. En este artículo, describimos un método para entregar con éxito agentes en el espacio intratecal lumbar colocando el extremo interno del catéter completamente en el espacio de la quinquina cauda de la columna vertebral de la rata. Mazur et al. en otros lugares11publicaron previamente una descripción de este procedimiento.
El protocolo es muy eficaz y produce una tasa de éxito superior al 90% de la entrega de oligonucleótidos antisentido (ASO) al SNC cuando se evalúa mediante un análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) del desenlace del gen objetivo8. El procedimiento causa un mínimo de malestar a los animales, ya que el 100% de las ratas sobreviven a la cirugía y muestran una hinchazón mínima alrededor de la herida quirúrgica y no hay signos de angustia (por ejemplo, hiperactividad, deshidratación, círculos, pérdida de equilibrio, disminución de la ingesta de alimentos y deshidratación) durante la observación postoperatoria. Otra ventaja del método descrito aquí es que no requiere equipos caros, ni herramientas especiales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente artículo muestra un método potente para administrar agentes terapéuticos directamente en el SNC de rata. En teoría, una técnica similar también se puede realizar en ratones, aunque debido al tamaño más pequeño, el método puede ser más difícil. Por lo tanto, nuestro grupo realiza inyecciones intracerebroventriculares (ICV) en ratones para la administración de fármacos del SNC, que alcanzan los mismos objetivos a través de una vía diferente de administración. Este método se ha descrito en otro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Ionis Pharmaceuticals por suministrar las ASOs descritas en el artículo.
Materials
| 3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture | 3M | 1020 | ||
| 70% ethanol | Decon Laboratories, Inc | 8416-160Z | ||
| Alcohol swab sticks | Dynarex | NO 1204 | ||
| BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip | BD | 1ml TB Luer-Lok tip | BD 302830 | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in | BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P) | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in | BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B) | |
| BD Intramedic PE Tubing Adapters | BD | 23 gauge intramedic luer stub adaper | BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E | 120V 1.2A |
| BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G | BD | BD 305128 | ||
| Buprenorphine Sustained Release-lab | ZooPharm | Prescription required | ||
| Ethylene oxide sterilizer | Andersen Sterilizer INC. | AN 74i, gas sterilizer | AN 74i | |
| Guide cannula | BD | 19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle | BD 305186 | |
| Hamilton syringe 100ul | Hamilton company | Hamilton syringe 100ul | ||
| Hot bead Sterilizer | Fine Science Tools | STERILIZER MODELNO FST 250 | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra veterranery product | 17033-211-38 | ||
| Pocket Pro Pet Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9931 B | ||
| Povidone scrub | PDI | S48050 | ||
| Saline | Baxter | Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml | FE1306G | |
| Scalpel | Feather | disposable scalpel | No. 10 | |
| Small animal heating pad | K&H Manufacturing | Model # 1060 | ||
| Stylet Wire | McMaster-Carr | 1749T14 | LH-36233780 | |
| Surgery Towel drape | Dynarex | 4410 | ||
| Surgical scissors and forceps | FST and Fisher Scientific | |||
| Sutures | Ethicon | 4-0 or 5-0 | ||
| Tool to make the Guide cannular | Grainger | Rotary tool (Dremel) | 14H446 (Mfr: EZ456) | 1.5” diameter, Pk5 |
| EZ lock cut off Wheel | 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24) | 1.5”, Pk2 | ||
| Grinding Wheel, Aluminum Oxide | 38EY44 (Mfr: EZ541GR) | |||
| EZ lock Mandrel | 1PKX8 (Mfr: EZ402-01) | 1.5” diameter | ||
| Diamond wheel floor Tile | 3DRN4 (Mfr: EZ545) | |||
| Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure | ||||
| Dosing catheter system | SAI Infusion Systems | RIDC-01 | ||
| Guide cannula | SAI Infusion Systems | RIDC-GCA | ||
| Internal Catheters | SAI Infusion Systems | RIDC-INC | ||
| Stylet Wire | SAI Infusion Systems | RIDC-STY |
References
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