Sıçan Merkezi Sinir Sisteminde Antisense Oligonükleotidlerin İntinal Teslimi
Summary
Burada, omurganın lomber intratekal uzayına bir kateter yerleştirerek sıçan merkezi sinir sistemine ilaç teslim etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem diğer terapötik yöntemlerin de teslimi için uygun olsa da, antisense oligonükleotidlerin teslimatına odaklanıyoruz.
Abstract
Kan beyin bariyeri (BBB) merkezi sinir sistemi (CNS) içine kan potansiyel toksik veya patojenik ajanların girişine karşı önemli bir savunmadır. Ancak, varlığı da önemli ölçüde CNS için sistematik olarak yönetilen terapötik ajanların erişilebilirliğini düşürür. Bunun üstesinden gelmek için bir yöntem, beyin omurilik sıvısı (BOS) içine doğrudan bu ajanları enjekte etmektir, böylece BBB atlayarak. Bu bir ozmotik pompa kullanarak sürekli infüzyon için bir kateter implantasyonu yoluyla yapılabilir, ya da tek bolus teslimat için. Bu makalede, cns hedefleyen antisense oligonükleotidlerin (ASOs) yetişkin sıçan omurgasının kauda equina alanına doğrudan yerleştirilen bir kateter aracılığıyla teslimi için bir cerrahi protokol açıklanır. Temsili sonuçlar olarak, sıçan CNS’nin farklı bölgelerinde hedef RNA’yı devirmede bu kateterizasyon sistemi ile tek bir bolus ASO intratekal (BT) enjeksiyonunun etkinliğini gösteriyoruz. Prosedür güvenli, etkili ve pahalı ekipman veya cerrahi aletler gerektirmez. Burada açıklanan teknik, diğer yöntemlerde de ilaç teslim etmek için uyarlanabilir.
Introduction
Merkezi sinir sisteminin vasküler sistemi (CNS) homeostaz kritik bir düzenleyici olarak gelişti, moleküllerin trafiğini kontrol, besin temini ve atık kurtulmak. Bu sistem aynı zamanda endotel hücrelerinin duvarları boyunca sıkı kavşakların yoğun dağılımı sayesinde, dış patojenlerin saldırılarına karşı ilk savunma hattıdır. Bu sıkı kavşaklar kan beyin bariyerinin bir yönünü oluşturan (BBB). BBB besin ve enerji taleplerini karşılamak için gerekli moleküllerin taşınmasına izin verirken (örneğin, iyonlar, glikoz), aynı zamanda seçici olarak patojenlerin yanı sıra toksik kimyasalların geçişini de sınırlandırır1,2,3.
İronik olarak, bbb’nin patojenlerin ve toksik kimyasalların geçişini sınırlayan aynı koruyucu işlevi de, organizmaya sistemik uygulamadan sonra cns’ye terapötik tedaviler ile kolayca erişebilme yeteneğimizin önündeki en büyük engeldir2, 4,5. BBB’nin bu rolü, yeni uyuşturucu dağıtım teknolojilerinin bir bolluk ve yaklaşımlar bir bolluk gelişimini yol açmıştır6.
Bu engeli aşmak için bir yolu sürekli beyin ve omurilikhemde perfuses beyin omurilik sıvısı (BOS) içine doğrudan ilaç enjekteetmektir 7 ,8,9,10. Bu makalede, kateterin iç ucunu tamamen sıçan omurgasının kauda equina alanına yerleştirerek ajanları lomber intratekal alana başarılı bir şekilde teslim etme yöntemini açıklıyoruz. Bu prosedürün bir açıklaması daha önce Mazur ve ark. başka bir yerde11tarafından yayınlanmıştır .
Protokol çok etkilidir ve hedef gen knockdown8kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi ile değerlendirildiğinde CNS’ye antisense oligonükleotid (ASO) teslimatının %90’dan daha büyük bir başarı oranı üretir. İşlem hayvanlar için en az rahatsızlığa neden olur, çünkü sıçanların %100’ü ameliyattan sağ kurtulur ve cerrahi yaranın etrafında en az şişlik ve herhangi bir sıkıntı belirtisi göstermez (örn. hiperaktivite, dehidratasyon, daire çizme, denge kaybı, gıda alımında azalma ve dehidratasyon) post-op gözlem sırasında. Burada açıklanan yöntemin bir diğer avantajı pahalı ekipman, ne de herhangi bir özel araçlar gerektirmez.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede sıçan CNS doğrudan terapötik ajanlar sunmak için güçlü bir yöntem gösterir. Teorik olarak, benzer bir teknik farelerde de yapılabilir, ancak küçük boyutu nedeniyle, yöntem daha zor olabilir. Bu nedenle, grubumuz, farklı bir uygulama yolu ile aynı hedeflere ulaşan CNS ilaç teslimatı için farelerde intracerebroventricular (ICV) enjeksiyonları gerçekleştirmelidir. Bu yöntem başka bir çalışmada16tanımlanmıştır.
Burada açıklanan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ionis Pharmaceuticals’a makalede açıklanan AsO’ları temin ettiği için teşekkür ederiz.
Materials
| 3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture | 3M | 1020 | ||
| 70% ethanol | Decon Laboratories, Inc | 8416-160Z | ||
| Alcohol swab sticks | Dynarex | NO 1204 | ||
| BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip | BD | 1ml TB Luer-Lok tip | BD 302830 | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in | BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P) | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in | BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B) | |
| BD Intramedic PE Tubing Adapters | BD | 23 gauge intramedic luer stub adaper | BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E | 120V 1.2A |
| BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G | BD | BD 305128 | ||
| Buprenorphine Sustained Release-lab | ZooPharm | Prescription required | ||
| Ethylene oxide sterilizer | Andersen Sterilizer INC. | AN 74i, gas sterilizer | AN 74i | |
| Guide cannula | BD | 19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle | BD 305186 | |
| Hamilton syringe 100ul | Hamilton company | Hamilton syringe 100ul | ||
| Hot bead Sterilizer | Fine Science Tools | STERILIZER MODELNO FST 250 | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra veterranery product | 17033-211-38 | ||
| Pocket Pro Pet Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9931 B | ||
| Povidone scrub | PDI | S48050 | ||
| Saline | Baxter | Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml | FE1306G | |
| Scalpel | Feather | disposable scalpel | No. 10 | |
| Small animal heating pad | K&H Manufacturing | Model # 1060 | ||
| Stylet Wire | McMaster-Carr | 1749T14 | LH-36233780 | |
| Surgery Towel drape | Dynarex | 4410 | ||
| Surgical scissors and forceps | FST and Fisher Scientific | |||
| Sutures | Ethicon | 4-0 or 5-0 | ||
| Tool to make the Guide cannular | Grainger | Rotary tool (Dremel) | 14H446 (Mfr: EZ456) | 1.5” diameter, Pk5 |
| EZ lock cut off Wheel | 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24) | 1.5”, Pk2 | ||
| Grinding Wheel, Aluminum Oxide | 38EY44 (Mfr: EZ541GR) | |||
| EZ lock Mandrel | 1PKX8 (Mfr: EZ402-01) | 1.5” diameter | ||
| Diamond wheel floor Tile | 3DRN4 (Mfr: EZ545) | |||
| Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure | ||||
| Dosing catheter system | SAI Infusion Systems | RIDC-01 | ||
| Guide cannula | SAI Infusion Systems | RIDC-GCA | ||
| Internal Catheters | SAI Infusion Systems | RIDC-INC | ||
| Stylet Wire | SAI Infusion Systems | RIDC-STY |
References
- Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
- Greene, C., Campbell, M. Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules. Tissue Barriers. 4 (1), e1138017 (2016).
- Daneman, R., Engelhardt, B. Brain barriers in health and disease. Neurobiology of Disease. 107, 1-3 (2017).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Research Reviews. 64 (2), 328-363 (2010).
- Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. E. Recent advances in delivery through the blood-brain barrier. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (9), 1148-1160 (2014).
- Brinker, T., Stopa, E., Morrison, J., Klinge, P. A new look at cerebrospinal fluid circulation. Fluids Barriers CNS. 11, 10 (2014).
- Standifer, K. M., Chien, C. C., Wahlestedt, C., Brown, G. P., Pasternak, G. W. Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor. Neuron. 12 (4), 805-810 (1994).
- Wahlestedt, C., et al. Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions. Nature. 363 (6426), 260-263 (1993).
- Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides. Science. 259 (5094), 528-531 (1993).
- Mazur, C., et al. Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).
- Wolf, D. A., et al. Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (2), e85311 (2016).
- Becker, L. A., et al. Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice. Nature. 544 (7650), 367-371 (2017).
- Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions. RNA Biology. 14 (12), 1705-1714 (2017).
- Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. RNA-Targeted Therapeutics. Cell Metabolism. 27 (4), 714-739 (2018).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3558-3567 (2018).
- Schoch, K. M., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases. Neuron. 94 (6), 1056-1070 (2017).
- Lane, R. M., et al. Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington’s Disease. Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).
- Wurster, C. D., Ludolph, A. C. Antisense oligonucleotides in neurological disorders. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).
- Haché, M., et al. Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience. Journal of Child Neurology. 31 (7), 899-906 (2016).
- Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy. Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).
- Wurster, C. D., Ludolph, A. C. Nusinersen for spinal muscular atrophy. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).
