התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים
Summary
האינטראקציה עם התרבות המשותף המוצגת בפרוטוקול זה היא זולה, תפוקה גבוהה ופשוטה. ניתן להשתמש בתנאים אלה כדי להתבונן באינטראקציות מיקרוביאלית בתרבות המשותף, לזהות דפוסי אינטראקציה, ולאפיין את הפוטנציאל המעונה של מאמץ מחיידקים של התעניינות במחלות אנושיות וסביבתיות.
Abstract
חקר האינטראקציות בין מיקרואורגניזמים הוביל לתגליות רבות, החל מantimicrobials הרומן ועד לתובנות בתחומי האקולוגיה. גישות רבות המשמשות לחקר אינטראקציות מיקרוביאלית דורשות ציוד מיוחד והינן יקרות ועתירות זמן. נייר זה מציג פרוטוקול לשיתוף פעולה עם תרבות שיתוף, כי הם זולים, מדרגיים למדגם מספרים גדולים, בקלות להתאמה לעיצובים ניסיוניים רבים. מיקרואורגניזמים הם מתורבתים יחד, עם כל המייצגים שילוב אחד זיווגים ומיקרואורגניזמים. אורגניזם מבחן הוא מתורבת בצד אחד של כל היטב מודבטים הראשון בתרבות מונוטוני. לאחר מכן, אורגניזמים היעד מחוסן בו על הצד הנגדי של כל באר באמצעות חותמת החיסון 3D-מודפס. לאחר שיתוף התרבות, השלימה הושלמה הבקיע עבור פנוטיפים חזותיים, כגון צמיחה או עיכוב. מספר זה יכול לשמש כדי לאשר פנוטיפים או לזהות דפוסים בין מבודד של עניין. באמצעות שיטה זו פשוטה ויעילה, משתמשים יכולים לנתח שילובים של מיקרואורגניזמים במהירות וביעילות. זו גישה שיתוף תרבות ישימה לגילוי אנטיביוטי, כמו גם מחקר מבוססי התרבות מיקרובידום והוחל כבר בהצלחה שני יישומים.
Introduction
בטבע, לעתים נדירות מיקרואורגניזמים קיימים בבידוד; כתוצאה מכך, הם מאינטראקציה ללא הרף עם אורגניזמים אחרים. לכן, לימוד כיצד מיקרואורגניזמים מתקשרים אחד עם השני הוא חיוני כדי להבין ריבוי של התנהגויות חיידקים1. אינטראקציות מיקרוביאלית יכולות להיות מדדיות, מיו, או אנטליסטית. אלה ב teractions יכול להשפיע לא רק את המיקרואורגניזמים עצמם אלא גם את הסביבות והמארחים כי המיקרואורגניזמים ליישב1,2.
מדענים רבים מחקר אינטראקציות מיקרוביאלית כדי לזהות מולקולות מיקרוביאלית חדש. אחד מולקולות קליניות מיקרוביאלית חשוב הראשון נמצא באמצעות המחקר של אינטראקציות מיקרוביאלית. סר אלכסנדר פלמינג הבחין מזהם Penicליום spp. בידוד כי עכבות את הצמיחה של זן סטייהילוקוקוס , אשר הוביל לגילוי של פניצילין אנטיביוטי נפוץ3. אפיון המנגנונים בהם משתמשים מיקרואורגניזמים כדי להרגיז את המתחרים שלהם נותר משאב פורה לגילוי מולקולות מיקרוביאלית. לדוגמה, זה הוכח לאחרונה כי Streptomyces sp. מאמץ Mg1 מייצרת linearmycins אנטיביוטי, אשר יש פעילות lytic ו degradative נגד מקרתגו subtilis4.
יתר על כן, פפטיד לא מסונתז בעלי שם לוגדאנב התגלתה לאחרונה לאחר התצפית כי האף המולוקוקוס מעכב אתמחלת הקוקוס המכונה5. מחקרים הראו גם כי אינטראקציות מדדיות בין המיקרואורגניזמים הם באותה מידה חזקה כמו אינטראקציות עוינת לגילוי של מולקולות מיקרוביאלית. לדוגמה, רבים פטריה-חקלאות נמלים בתוך השבט Attini חיידקים סימביוטי המכונה Pseudonocardia על השלד החיצוני שלהם שמייצר מולקולות פטריות כדי לעכב את הפתוגן מחייב של יבול פטרייתי שלהם6. כמו המחקר של אינטראקציות מיקרוביאלית כבר מועיל לגילוי מולקולות מיקרוביאלית, השימוש במסכים תפוקה גבוהה עלול לגרום לגילוי של מולקולות מיקרוביאלית חדשים.
ביחס לעלות ולקלות הביצועים, המתודולוגיות המשמשות לחקר האינטראקציות של מיקרוביאלית נעות בין פשוטה למורכבת. למשל, שיטת התקע אגר היא שיטה זולה ופשוטה שניתן להשתמש בה כדי לחקור את האנטניזם בין מיקרואורגניזמים מרובים7. עם זאת, שיטת התקע של אגר אינה הליך יעיל והיא יכולה להיות אינטנסיבית לעבודה עבור שילובים רבים של זיווגים. כדי להעריך את ההשפעות של מוצרים מתוצרת microbially על מבודד היעד של עניין באופן תפוקה גבוהה, מעבדות רבות להשתמש הדיסק דיפוזיה בחני8. שמות אלה הם קלים וזולים יכול להיות מדרגי למספר גבוה יותר של דגימות7. עם זאת, מעשה זה דורש את הדור של תמציות מיקרוביאלית ועשוי לייצר תוצאות מטעה עבור צירופים מסוימים של אורגניזמים ואנטיביוטיקה היעד, כגון סלמונלה ו צפלוספורנס9.
הגישות הקודמות מסתמכות על רכיבים מבודדים כדי לעורר תגובה באורגניזם מטרה, במקום לאפשר למיקרואורגניזמים לקיים אינטראקציה זה עם זה. זה של הערה משום שאינטראקציות בין חיידקים עשוי לעורר את הייצור של מולקולות מיקרוביאלית של “סודי” שאינם מיוצרים בתרבית. למשל, זה הוכח לאחרונה כי keyicin מיקרוביאלית מופק רק על ידי מיקרוונוספורמטר sp. כאשר משותף לתרבות עם מעלה sp. כי הוא מבודד מיקרובידום ספוג אותו10. מתודולוגיות אינטרקציה מורכבות יותר מאפשרות לעקוף את העיכוב הפוטנציאלי בתרבות המונאלית. למשל, ה-iChip שימושי לבידוד נדיר וקשה לטיפוח חיידקים מדגימות סביבתיות ומאפשר התבוננות באינטראקציות מיקרוביאלית באמצעות צמיחה באתרו11. כדי לחקור את האינטראקציות בפרוטרוט, מטריקס סייעה להשתמש בהדמיית לייזר להדמיה בזמן של טיסת הדמיה של המסה ספקטרומטריה (MALDI-תוף-IMS). גישה זו מספקת מידע מפורט על הרכב והפצה של מולקולות קטנות פפטידים המיוצר על ידי אינטראקציה מושבות מיקרוביאלית עם רזולוציה מרחבית גבוהה. Maldi-תוף-IMS שימש גם במחקרים מרובים של אינטראקציות חיידקי כדי לאפיין את מנגנוני התחרות12,13,14,15. עם זאת, MALDI-תוף-IMS לעתים קרובות דורש הכנה לדוגמה מפרך, מומחיות מיוחדת כדי להפעיל את הציוד, ואת יקר ומיוחדות ספקטרומטר מסה. מסיבות אלה, זוהי טכניקה קשה לשימוש עבור לימודי תפוקה גבוהה. לפיכך, שיטת שיתוף תרבות פשוטה, מדרגית ובעלת תפוקה גבוהה עבור אינטראקציות מיקרוביאלית הגוברת על מגבלות רבות של הגישות הנ ל יהיו מועילות.
כאן מוצג פרוטוקול לתרבות מיקרוביאלית של תפוקה גבוהה. מעשה זה פשוט ומשולב בקלות למחקרים קיימים של אינטראקציות מיקרוביאלית. בניגוד לשיטות רבות בשימוש נפוץ לחקר האינטראקציות של חיידקים, השיטה שלנו היא פשוטה, זולה, והיא קלה לחקירת מספר רב של אינטראקציות. מספר זה לא רק קל לביצוע, אבל החומרים זמינים באופן נרחב מרוב ספקי המעבדה או משאבים ציבוריים (למשל, ספריות, makerspaces). כתוצאה מכך, שיטת החקירה הזאת היא יתרון כשורה ראשונה לזיהוי וניתוח דפוסים מעניינים בקרב שילובי זיווגים רבים של מיקרואורגניזמים, שעשויים להועיל במיוחד לחקירת האקולוגיה של מיקרוביאלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנטיביוטיקה ומטבוליטים משניים אחרים הבתווך אינטראקציות מיקרוביאלית שימושיות עבור שפע של יישומים, כולל גילוי סמים. במסמך זה, פרוטוקול לשיתוף התרבות המשותף מציג להערכת מספר רב של אינטראקציות מיקרוביאלית. אלה שיתוף התרבות ההדדית האינטראקציה היא פשוטה, סבירים, מדרגי, תפוקה גבוהה פירושו לחק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לדניאל מאי, מארק שירט ודון ואנג על הקריאה הקריטית של כתב היד. עבודה זו, כולל המאמצים של קמרון R. קורי, נתמכת על ידי אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון, משרד סגן הקנצלר למחקר ובוגר השכלה עם מימון של הקרן למחקר ויסקונסין בוגרים, מימון שסופק גם על ידי ה המכונים הלאומיים למרכזי בריאות למצוינות במחקר טרנסלtional (U19-AI109673-01). ריד מ. סטובננק נתמך על ידי הספרייה הלאומית של מענק הכשרת הרפואה למחשוב ולאינפורמטיקה בתוכנית ההכשרה לביולוגיה ולרפואה (NLM 5T15LM007359). לתורמים לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, באיסוף הנתונים ובפרשנות, או בהחלטה להגיש את העבודה לפרסום.
Materials
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
References
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234 (2016).
- Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).
- Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226 (1929).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11 (12), e1005722 (2015).
- Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).
- Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. , (2012).
- Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).
- Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
- Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).
- Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).
- Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).
- Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).
- Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10 (1), 516 (2019).
