Co-Culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties
Summary
De co-cultuur interactie testen gepresenteerd in dit protocol zijn goedkoop, hoge doorvoer, en eenvoudig. Deze testen kunnen worden gebruikt om microbiële interacties in co-cultuur te observeren, interactie patronen te identificeren en het remmende potentieel van een microbiële stam van belang tegen menselijke en milieu pathogenen te karakteriseren.
Abstract
De studie van interacties tussen micro-organismen heeft geleid tot tal van ontdekkingen, van nieuwe antimicrobiële stoffen tot inzichten in microbiële ecologie. Veel benaderingen die worden gebruikt voor de studie van microbiële interacties vereisen gespecialiseerde apparatuur en zijn duur en tijd intensief. Dit artikel presenteert een protocol voor co-cultuur interactie testen die goedkoop, schaalbaar zijn tot grote sample-nummers, en gemakkelijk aanpasbaar aan tal van experimentele ontwerpen. Micro-organismen worden samen gekweekt, waarbij elk goed één paarsgewijze combinatie van micro-organismen vertegenwoordigt. Een testorganisme wordt aan één zijde van elk goed gekweekt en eerst geïnineerd in monocultuur. Vervolgens worden doelorganismen gelijktijdig op de tegenoverliggende zijde van elke put geënt met behulp van een 3D-gedrukte inoculatie stempel. Na co-cultuur worden de voltooide testen gescoord voor visuele fenotypes, zoals groei of remming. Deze testen kunnen worden gebruikt om fenotypes te bevestigen of patronen te identificeren tussen isolaten van belang. Met deze eenvoudige en effectieve methode kunnen gebruikers combinaties van micro-organismen snel en efficiënt analyseren. Deze co-cultuur aanpak is van toepassing op antibiotica ontdekking, evenals op cultuur gebaseerde microbiome onderzoek en is al met succes toegepast op beide toepassingen.
Introduction
In de natuur bestaan micro-organismen zelden geïsoleerd; Dientengevolge, ze zijn voortdurend interactie met andere organismen. Daarom is het essentieel om een veelheid van microbiële gedragingen te begrijpen1, om te bestuderen hoe micro-organismen met elkaar omgaan. Microbiële interacties kunnen mutualistisch, commensaal of antagonistisch zijn. Deze in teractions kan invloed hebben op niet alleen de micro-organismen zelf, maar ook de omgevingen en hosts die de micro-organismen koloniseren1,2.
Veel wetenschappers bestuderen microbiële interacties om nieuwe antimicrobiële moleculen te identificeren. Een van de eerste klinisch belangrijke antimicrobiële moleculen werd gevonden door de studie van microbiële interacties. Sir Alexander Fleming observeerde een contaminerend Penicillium spp. isolaat dat de groei van een Staphylococcus -stam inhiemde, wat leidde tot de ontdekking van de veelgebruikte antibiotica penicillaire3. Karakterisering van de mechanismen die micro-organismen gebruiken om hun concurrenten te antagoniseren blijft een vruchtbare bron voor de ontdekking van antimicrobiële moleculen. Bijvoorbeeld, het werd onlangs aangetoond dat Streptomyces SP. stam Mg1 produceert antibioticum linearmycinen, die hebben een lytische en degradatieve activiteit tegen Bacillus subtilis4.
Verder werd een niet-ribosomaal gesynthetiseerd peptide, genaamd lugdunin, onlangs ontdekt na de constatering dat de nasale commensale Staphylococcus Lugdunensis Staphylococcus aureus5remt. Studies hebben ook aangetoond dat mutualistische interacties tussen micro-organismen even krachtig zijn als antagonistische interacties voor de ontdekking van antimicrobiële moleculen. Bijvoorbeeld, veel schimmel-landbouw mieren in de stam attini haven symbiotische bacteriën genoemd pseudonocardia op hun exoskelet die schimmelwerende moleculen produceert voor de remming van een verplicht pathogeen van hun schimmel gewas6. Omdat de studie van microbiële interacties gunstig is geweest voor het ontdekken van antimicrobiële moleculen, kan het gebruik van hoge doorvoer schermen resulteren in de ontdekking van nieuwe antimicrobiële moleculen.
Met betrekking tot de kosten en het gemak van de prestaties, de methoden die worden gebruikt voor het bestuderen van microbiële interacties variëren van eenvoudig tot complex. Een agar-plug assay is bijvoorbeeld een goedkope en eenvoudige methode die kan worden gebruikt om antagonisme tussen meerdere micro-organismen7te onderzoeken. Een agar-plug assay is echter geen efficiënte procedure en kan arbeidsintensief zijn voor veel Pairwise-combinaties. Om de effecten van microbieel geproduceerde producten op doel isolaten van belang in een hoge doorvoer manier te beoordelen, gebruiken veel laboratoria schijf diffusie testen8. Deze assays zijn gemakkelijk en goedkoop en kunnen schaalbaar zijn tot hogere aantallen monsters7. Deze bepaling vereist echter het opwekken van microbiële extracten en kan misleidende resultaten opleveren voor bepaalde combinaties van doelorganismen en antibiotica, zoals salmonella en cefalosporinen9.
De voorgaande benaderingen zijn afhankelijk van geïsoleerde componenten om een reactie te lokken in een doelorganisme, in plaats van het toestaan van micro-organismen om met elkaar te communiceren. Dit is van merk, omdat de interacties tussen microben kan de productie van “cryptische” antimicrobiële moleculen die niet worden geproduceerd in monocultuur ontlokken. Bijvoorbeeld, het werd onlangs aangetoond dat de antimicrobiële keyicin alleen wordt geproduceerd door een Micromonospora SP. Wanneer co-gekweekte met een Rhodococcus SP. dat is geïsoleerd van dezelfde spons microbiome10. Complexere interactie methodieken omzeilen deze potentiële monocultuur belemmering. De iChip is bijvoorbeeld handig voor het isoleren van zeldzame en moeilijk te kweken bacteriën uit milieu monsters en maakt het mogelijk om microbiële interacties te observeren door middel van groei in situ11. Om interacties in detail te onderzoeken, kan matrix geassisteerde Laser desorptie/ionisatie time-of-Flight Imaging Mass spectrometrie (MALDI-TOF-IMS) worden gebruikt. Deze aanpak biedt gedetailleerde informatie over de samenstelling en distributie van kleine moleculen en peptiden geproduceerd door het interageren van microbiële kolonies met een hoge ruimtelijke resolutie. MALDI-tof-IMS is ook gebruikt in meerdere studies van bacteriële interacties om de mechanismen van de competitie te karakteriseren12,13,14,15. Echter, MALDI-TOF-IMS vereist vaak bewerkelijk monstervoorbereiding, gespecialiseerde expertise om de apparatuur te bedienen, en dure en gespecialiseerde massaspectrometers. Om deze redenen is het een moeilijke techniek om te gebruiken voor studies met een hoge doorvoer. Dus, een eenvoudige, schaalbare en co-cultuur test met hoge doorvoer voor microbiële interacties die veel beperkingen van de bovenstaande benaderingen overkomt, zou gunstig zijn.
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een hoge doorvoer van microbiële co-cultuur. Deze test is eenvoudig en gemakkelijk te integreren in reeds bestaande onderzoeken naar microbiële interacties. In tegenstelling tot veel veelgebruikte methoden voor de studie van microbiële interacties, onze methode is eenvoudig, goedkoop, en is vatbaar voor onderzoek naar grote aantallen interacties. Deze testen zijn niet alleen gemakkelijk uit te voeren, maar de materialen zijn op grote schaal verkrijgbaar bij de meeste laboratorium leveranciers of openbare bronnen (bijv. bibliotheken en makerspaces). Bijgevolg is deze test voordelig als een eerste onderzoekslijn om interessante patronen te identificeren en te parseren tussen vele combinaties van micro-organismen, die vooral nuttig kunnen zijn voor het onderzoek naar microbiële ecologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antibiotica en andere secundaire metabolieten die microbiële interacties bemiddelen, zijn nuttig voor een veelheid aan toepassingen, waaronder het opsporen van geneesmiddelen. Hierin wordt een protocol voor co-Culture-assays gepresenteerd om grote aantallen microbiële interacties te beoordelen. Deze co-cultuur interactie assays zijn een eenvoudige, betaalbare, schaalbare en hoge doorvoer middelen om te onderzoeken veel Pairwise combinaties van micro-organismen in tandem. Doelorganismen worden naast testorganismen in ee…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Daniel May, Marc Chevrette en Don Hoang voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk, met inbegrip van de inspanningen van Cameron R. Currie, werd gesteund door de Universiteit van Wisconsin-Madison, kantoor van de vice-kanselier voor onderzoek en Graduate Education met financiering van de Wisconsin Alumni Research Foundation, financiering ook verstrekt door de National Institutes of Health Centers for Excellence voor translationeel onderzoek (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck werd gesteund door een nationale bibliotheek van geneeskunde opleiding subsidie aan de berekening en informatica in biologie en geneeskunde opleiding programma (NLM 5T15LM007359). De financiers hadden geen rol in studie ontwerp, gegevensverzameling en interpretatie, of de beslissing om het werk voor publicatie in te dienen.
Materials
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
References
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234 (2016).
- Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).
- Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226 (1929).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11 (12), e1005722 (2015).
- Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).
- Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. , (2012).
- Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).
- Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
- Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).
- Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).
- Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).
- Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).
- Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10 (1), 516 (2019).
