Tests de co-culture à haut débit pour l'étude des interactions microbiennes
Summary
Les tests d’interaction de co-culture présentés dans ce protocole sont peu coûteux, haut débit, et simple. Ces essais peuvent être utilisés pour observer les interactions microbiennes dans la co-culture, identifier les modèles d’interaction et caractériser le potentiel inhibiteur d’une souche microbienne d’intérêt contre les agents pathogènes humains et environnementaux.
Abstract
L’étude des interactions entre micro-organismes a mené à de nombreuses découvertes, allant de nouveaux antimicrobiens à des connaissances en écologie microbienne. De nombreuses approches utilisées pour l’étude des interactions microbiennes nécessitent un équipement spécialisé et sont coûteuses et chronoplient. Cet article présente un protocole pour les tests d’interaction de co-culture qui sont peu coûteux, évolutifs à de grands nombres d’échantillons, et facilement adaptables à de nombreuses conceptions expérimentales. Les micro-organismes sont cultivés ensemble, chacun représentant une combinaison de micro-organismes. Un organisme d’essai est cultivé d’un côté de chaque puits et est d’abord incubé en monoculture. Par la suite, les organismes cibles sont simultanément inoculés sur le côté opposé de chaque puits à l’aide d’un timbre d’inoculation imprimé en 3D. Après la co-culture, les essais terminés sont notés pour les phénotypes visuels, tels que la croissance ou l’inhibition. Ces essais peuvent être utilisés pour confirmer les phénotypes ou identifier les modèles parmi les isolats d’intérêt. Grâce à cette méthode simple et efficace, les utilisateurs peuvent analyser les combinaisons de micro-organismes rapidement et efficacement. Cette approche de co-culture s’applique à la découverte d’antibiotiques ainsi qu’à la recherche sur le microbiome basée sur la culture et a déjà été appliquée avec succès aux deux applications.
Introduction
Dans la nature, les micro-organismes existent rarement isolément; par conséquent, ils interagissent constamment avec d’autres organismes. Par conséquent, l’étude de la façon dont les micro-organismes interagissent les uns avec les autres est essentielle pour comprendre une multitude de comportements microbiens1. Les interactions microbiennes peuvent être mutualistes, commensales ou antagonistes. Ces teractions peuvent affecter non seulement les micro-organismes eux-mêmes, mais aussi les environnements et les hôtes que les micro-organismes colonisent1,2.
De nombreux scientifiques étudient les interactions microbiennes pour identifier de nouvelles molécules antimicrobiennes. L’une des premières molécules antimicrobiennes cliniquement importantes a été trouvée grâce à l’étude des interactions microbiennes. Sir Alexander Fleming a observé un isolat contaminant de penicillium qui a inhibé la croissance d’une souche de Staphylococcus, qui a mené à la découverte de la pénicilline antibiotique couramment utilisée3. La caractérisation des mécanismes que les micro-organismes utilisent pour contrarier leurs concurrents reste une ressource fructueuse pour la découverte de molécules antimicrobiennes. Par exemple, il a été récemment montré que Streptomyces sp. souche Mg1 produit des linearmycins antibiotiques, qui ont une activité lytique et dégradative contre Bacillus subtilis4.
En outre, un peptide non-ribosomally synthétisé nommé lugdunin a été récemment découvert après l’observation que nasal commensal Staphylococcus lugdunensis inhibe Staphylococcus aureus5. Des études ont également montré que les interactions mutualistes entre micro-organismes sont tout aussi puissantes que les interactions antagonistes pour la découverte de molécules antimicrobiennes. Par exemple, de nombreuses fourmis cultivantes de champignons de la tribu Attini abritent des bactéries symbiotiques appelées Pseudonocardia sur leur exosquelette qui produit des molécules antifongiques pour inhiber un agent pathogène obligatoire de leur culture fongique6. Comme l’étude des interactions microbiennes a été bénéfique pour la découverte de molécules antimicrobiennes, l’utilisation d’écrans à haut débit peut entraîner la découverte de nouvelles molécules antimicrobiennes.
En ce qui concerne le coût et la facilité de performance, les méthodologies utilisées pour étudier les interactions microbiennes vont de simples à complexes. Par exemple, un test de prise d’agar est une méthode peu coûteuse et simple qui peut être employée pour étudier l’antagonisme entre les micro-organismes multiples7. Cependant, un analyse de prise d’agar n’est pas une procédure efficace et peut être laborieux pour beaucoup de combinaisons pairewise. Pour évaluer les effets des produits produits microbiens sur les isolats cibles d’intérêt d’une manière à haut débit, de nombreux laboratoires utilisent des tests de diffusion de disques8. Ces essais sont faciles et peu coûteux et peuvent être évolutifs à un nombre plus élevé d’échantillons7. Cependant, cet essai nécessite la production d’extraits microbiens et peut produire des résultats trompeurs pour certaines combinaisons d’organismes cibles et d’antibiotiques, tels que Salmonella et céphalosporines9.
Les approches précédentes reposent sur des composants isolés pour susciter une réponse dans un organisme cible, au lieu de permettre aux micro-organismes d’interagir les uns avec les autres. Ceci est à noter parce que les interactions entre les microbes peuvent provoquer la production de molécules antimicrobiennes « cryptiques » qui ne sont pas produites en monoculture. Par exemple, il a été récemment démontré que le keyicine antimicrobien n’est produit que par un Micromonospora sp. lorsqu’il est co-cultivé avec un Rhodococcus sp. qui est isolé du microbiome éponge même10. Des méthodologies d’interaction plus complexes contournent cet obstacle potentiel de monoculture. Par exemple, l’iChip est utile pour isoler les bactéries rares et difficiles à cultiver à partir d’échantillons environnementaux et permet l’observation des interactions microbiennes par la croissance in situ11. Pour étudier les interactions en détail, la spectrométrie de masse d’imagerie par imagerie par imagerie par imagerie par laser assistée par matrice (MALDI-TOF-IMS) peut être utilisée. Cette approche fournit des informations détaillées sur la composition et la distribution de petites molécules et peptides produites par des colonies microbiennes en interaction avec une haute résolution spatiale. MALDI-TOF-IMS a également été utilisé dans de multiples études d’interactions bactériennes pour caractériser les mécanismes de la concurrence12,13,14,15. Cependant, MALDI-TOF-IMS nécessite souvent une préparation laborieuse d’échantillons, une expertise spécialisée pour faire fonctionner l’équipement et des spectromètres de masse coûteux et spécialisés. Pour ces raisons, il est difficile d’utiliser une technique pour les études à haut débit. Ainsi, un test de co-culture simple, évolutif et à haut débit pour les interactions microbiennes qui surmonte de nombreuses limites des approches ci-dessus serait bénéfique.
Ici, un protocole pour la co-culture microbienne à haut débit est présenté. Cet test est simple et facilement intégré dans les études préexistantes des interactions microbiennes. Contrairement à de nombreuses méthodes couramment utilisées pour l’étude des interactions microbiennes, notre méthode est simple, peu coûteuse, et est prête à étudier un grand nombre d’interactions. Ces essais sont non seulement faciles à réaliser, mais les matériaux sont largement disponibles auprès de la plupart des fournisseurs de laboratoire ou des ressources publiques (p. ex., bibliothèques et makerspaces). Par conséquent, cet analyse est avantageux comme première ligne d’investigation pour identifier et analyser les modèles intéressants parmi de nombreuses combinaisons de micro-organismes, ce qui peut être particulièrement utile pour l’étude de l’écologie microbienne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les antibiotiques et autres métabolites secondaires qui font la médiation des interactions microbiennes sont utiles pour une multitude d’applications, y compris la découverte de médicaments. Ici, un protocole pour les essais de co-culture pour évaluer un grand nombre d’interactions microbiennes est présenté. Ces tests d’interaction de co-culture sont un moyen simple, abordable, évolutif, et haut débit pour étudier de nombreuses combinaisons de micro-organismes en tandem. Les organismes cibles sont repérés à …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Daniel May, Marc Chevrette et Don Hoang pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail, y compris les efforts de Cameron R. Currie, a été soutenu par l’Université du Wisconsin-Madison, Bureau du vice-chancelier pour la recherche et l’éducation des diplômés avec un financement de la Wisconsin Alumni Research Foundation, financement également fourni par le National Institutes of Health Centers for Excellence for Translational Research (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck a reçu l’appui d’une subvention de formation de la Bibliothèque nationale de médecine au Programme de formation en informatique et en informatique en biologie et en médecine (NLM 5T15LM007359). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’interprétation des données, ni dans la décision de soumettre l’œuvre à la publication.
Materials
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
References
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234 (2016).
- Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).
- Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226 (1929).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11 (12), e1005722 (2015).
- Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).
- Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. , (2012).
- Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).
- Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
- Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).
- Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).
- Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).
- Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).
- Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10 (1), 516 (2019).
