미생물 상호 작용의 조사를 위한 높은 처리량 공동 문화 애세서
Summary
이 프로토콜에 제시된 공동 문화 상호 작용 분석은 저렴하고 높은 처리량이며 간단합니다. 이 계산은 공동 배양에 있는 미생물 상호 작용을 관찰하고, 상호 작용 패턴을 확인하고, 인간과 환경 병원체에 대하여 관심있는 미생물 긴장의 억제 잠재력을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Abstract
미생물 간의 상호 작용에 대한 연구는 새로운 항균제에서 미생물 생태학의 통찰력에 이르기까지 수많은 발견으로 이어졌습니다. 미생물 상호 작용의 연구에 사용되는 많은 접근 은 특수 장비를 필요로하고 비싸고 시간 집약적입니다. 이 백서는 저렴하고, 큰 샘플 수로 확장 가능하며, 수많은 실험 설계에 쉽게 적응할 수 있는 공동 배양 상호 작용 분석프로토콜을 제시합니다. 미생물은 함께 배양되며, 각각의 우물은 미생물의 쌍으로 조합을 나타냅니다. 시험 유기체는 각 우물의 한쪽에 배양되고 먼저 단일 배양에서 배양됩니다. 그 후, 표적 유기체는 3D 인쇄 접종 스탬프를 사용하여 각 우물의 반대쪽에 동시에 접종됩니다. 공동 배양 후, 완성된 어소시에이스는 성장 또는 억제와 같은 시각적 표현형에 대해 채점된다. 이 계산은 표현형을 확인하거나 관심의 격리 중 패턴을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 간단하고 효과적인 방법을 사용하여 사용자는 미생물의 조합을 신속하고 효율적으로 분석 할 수 있습니다. 이 공동 배양 접근법은 항생제 발견뿐만 아니라 배양 기반 미생물군유전체 연구에 적용가능하며 이미 두 응용 분야에 성공적으로 적용되었습니다.
Introduction
자연에서 미생물은 거의 고립되어 존재하지 않습니다. 따라서, 그들은 지속적으로 다른 유기체와 상호 작용하고 있습니다. 따라서 미생물이 서로 상호 작용하는 방식을 연구하는 것은 수많은 미생물 행동을 이해하는 데 필수적입니다1. 미생물 상호 작용은 상호, 공생, 또는 길항제 일 수 있습니다. 이 것들은 미생물 자체뿐만 아니라 미생물이1,2를식민지화하는 환경과 숙주에도 영향을 미칠 수 있습니다.
많은 과학자들은 새로운 항균 분자를 확인하기 위해 미생물 상호 작용을 연구합니다. 첫 번째 임상적으로 중요 한 항균 분자 중 하나는 미생물 상호 작용의 연구를 통해 발견 되었다. 경 알렉산더 플레밍은 오염 페니실륨 종자를 관찰. 황색 포도상 구균 균주의 성장을 억제 분리, 이는 일반적으로 사용되는 항생제 페니실린의 발견을 주도3. 미생물이 경쟁사를 적대하는 데 사용하는 메커니즘의 특성화는 항균 분자의 발견을위한 유익한 자원으로 남아 있습니다. 예를 들어, 최근 스트렙토마이스 스프랭크 Mg1이 항생제 라인아미신을 생산하는 것으로 나타났으며, 이는 바실러스 서브틸리스4에대한 용염및 분해 활성을 갖는다.
또한, 루그두닌이라는 비리보솜 합성 펩티드는 최근 비강 공생황색포도상구균 루그두넨시스가 황색포도상구균5를억제한다는 관찰 을 받은 후발견되었다. 연구는 또한 미생물 간의 상호 상호 상호 작용은 항균 분자의 발견에 대 한 길항 상호 작용으로 동등 하 게 강력한 나타났습니다. 예를 들어, 아티니 항구 공생 박테리아에 있는 많은 곰팡이 농업 개미는 그들의 진균 작물의 의무 병원체를 억제하기 위하여 항진균 분자를 생성하는 그들의 외골격에 슈도노카디아에게 불린6. 미생물 상호 작용의 연구는 항균 분자를 발견에 대 한 도움이 되었습니다., 높은 처리량 스크린의 사용 새로운 항균 분자의 발견귀착될 수 있습니다.
비용과 성능의 용이성에 관하여, 미생물 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 방법론은 간단한에서 복잡한 범위. 예를 들어, 한천 플러그 분석법은 여러 미생물 사이의 적대감을 조사하는 데 사용할 수있는 저렴하고 간단한 방법입니다7. 그러나, 한천 플러그 분석은 효율적인 절차가 아니며 많은 쌍으로 조합에 대한 노동 집약적 일 수있다. 미생물로 생산된 제품이 높은 처리량 방식으로 관심 있는 표적 분리에 미치는 영향을 평가하기 위해 많은 실험실에서 디스크 확산 검정 을 사용합니다8. 이러한 검사는 쉽고 저렴하며 샘플7의더 많은 수로 확장 할 수 있습니다. 그러나, 이러한 분석법은 미생물 추출물의 생성을 필요로 하며 살모넬라 및 세팔로스포린스9와같은 표적 유기체 및 항생제의 특정 조합에 대해 오해의 소지가 있는 결과를 생성할 수 있다.
선행 접근법은 미생물이 서로 상호 작용하는 대신, 표적 유기체에 있는 반응을 이끌어 내는 격리된 분대에 의존합니다. 이것은 미생물 간의 상호 작용이 단일 배양에서 생산되지 않는 “비밀스러운”항균 분자의 생산을 유도 할 수 있기 때문에 주의입니다. 예를 들어, 최근에는 항균 키이신이 동일한 스폰지 미생물군유전체10으로부터분리되는 로도코쿠스 스프로도코쿠스와 병용배할 때 에 의해서만 마이크로모노스포라 스프로 생산되는 것으로 나타났다. 더 복잡한 상호 작용 방법론은 이러한 잠재적단일 문화 장애를 우회합니다. 예를 들어, iChip은 환경 샘플로부터 박테리아를 배양하기 어렵고 희귀하고 어려운 분리에 유용하며,11번소자에서의 성장을 통한 미생물 상호작용의 관찰을 가능하게 한다. 상호 작용을 자세히 조사하기 위해 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 시간(MALDI-TOF-IMS)을 사용할 수 있습니다. 이 접근법은 높은 공간 분해능으로 미생물 식민지를 상호 작용하여 생성된 소분자 및 펩타이드의 조성 및 분포에 대한 자세한 정보를 제공합니다. MALDI-TOF-IMS는 또한 경쟁12,13,14,15의메커니즘을 특성화하기 위해 세균 상호 작용의 다중 연구에서 사용되어 왔다. 그러나 MALDI-TOF-IMS는 종종 까다로운 시료 준비, 장비를 작동하기 위한 전문 지식, 고가의 특수 질량 분석기를 필요로 합니다. 이러한 이유로 높은 처리량 연구에 사용하기가 어렵습니다. 따라서, 상기 접근법의 많은 한계를 극복하는 미생물 상호작용에 대한 간단하고 확장 가능하며 높은 처리량의 공동 배양 분석이 유익할 것이다.
여기서, 높은 처리량 미생물 공동 배양에 대한 프로토콜이 제시된다. 이 분석법은 간단하고 쉽게 미생물 상호 작용의 기존 연구에 통합. 미생물 상호 작용의 연구를 위해 일반적으로 사용되는 많은 방법과는 달리, 우리의 방법은 간단하고 저렴하며 많은 수의 상호 작용을 조사할 수 있습니다. 이러한 어설미는 수행하기 쉬울 뿐만 아니라 대부분의 실험실 공급업체 또는 공공 자원(예: 라이브러리 및 메이커스페이스)에서 널리 사용할 수 있습니다. 따라서, 이 분석은 미생물의 많은 쌍으로 조합 중 흥미로운 패턴을 확인하고 구문 분석하는 조사의 첫 번째 라인으로 유리하다, 이는 미생물 생태학의 조사에 특히 유용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미생물 상호 작용을 중재하는 항생제 및 기타 이차 대사 산물은 약물 발견을 포함한 다양한 응용 분야에 유용합니다. 본 명세서에서, 많은 수의 미생물 상호작용을 평가하기 위한 공동 배양 분석에 대한 프로토콜이 제시된다. 이러한 공동 배양 상호 작용 검사는 간단하고 저렴하며 확장 가능하며 처리량이 높은 미생물의 많은 쌍조합을 나란히 조사하는 것을 의미합니다. 표적 유기체는 접종 스탬?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고의 비판적 독서에 대한 다니엘 월, 마크 체브렛, 돈 호앙 감사합니다. 카메론 R. 커리의 노력을 포함하여이 작품은 위스콘신 – 매디슨 대학, 위스콘신 동창 연구 재단의 자금으로 연구 및 대학원 교육 부총장 사무실의 지원, 또한 에 의해 제공 된 자금 번역 연구를위한 우수성에 대한 보건 센터의 국립 연구소 (U19-AI109673-01). 리드 M. Stubbendieck 는 생물학 및 의학 교육 프로그램의 전산 및 정보학에 대한 국립 의학 교육 보조금 (NLM 5T15LM007359)에 의해 지원되었습니다. 기금 모금자는 연구 디자인, 데이터 수집 및 해석, 또는 출판을 위해 작품을 제출하기로 결정에 아무런 역할이 없었다.
Materials
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
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