Høy gjennomstrømming co-kultur analyser for etterforskning av mikrobielle interaksjoner

Summary

Co-kulturen samhandling analysene presentert i denne protokollen er billig, høy gjennomstrømming, og enkel. Disse analysene kan brukes til å observere mikrobielle interaksjoner i co-kultur, identifisere interaksjon mønstre, og karakterisere den hemmende potensialet i en mikrobiell stamme av interesse mot menneskelige og miljømessige patogener.

Abstract

Studiet av interaksjoner mellom mikroorganismer har ført til en rekke funn, fra romanen antimikrobielle stoffer til innsikt i mikrobiell økologi. Mange tilnærminger brukes til studiet av mikrobielle interaksjoner krever spesialisert utstyr og er dyre og tidkrevende. Dette papiret presenterer en protokoll for co-kultur samhandling analyser som er billig, skalerbar til store utvalg tall, og lett tilpasses til en rekke eksperimentelle design. Mikroorganismer er kultivert sammen, med hver brønn representerer en parvis kombinasjon av mikroorganismer. En test organisme er kultivert på den ene siden av hver brønn og første inkubert i monokultur. Deretter mål organismer er samtidig inokulert på motsatt side av hver brønn ved hjelp av en 3D-trykt inoculation stempel. Etter co-kultur, de fullførte analysene er scoret for visuell fenotyper, for eksempel vekst eller hemming. Disse analysene kan brukes til å bekrefte fenotyper eller identifisere mønstre blant isolat av interesse. Ved hjelp av denne enkle og effektive metoden, kan brukerne analysere kombinasjoner av mikroorganismer raskt og effektivt. Denne co-kulturen tilnærmingen er gjeldende for antibiotika funn samt kultur-basert mikrobiomet forskning og har allerede blitt brukt på begge programmene.

Introduction

I naturen, mikroorganismer sjelden eksisterer i isolasjon; Følgelig er de stadig i samspill med andre organismer. Derfor studere hvordan mikroorganismer samhandle med hverandre er avgjørende for å forstå en rekke mikrobiell atferd¹. Mikrobiell interaksjon kan være mutualistic, Commensal, eller fiendtlig innstilt. Disse i teractions kan påvirke ikke bare mikroorganismer selv, men også miljøer og verter at mikroorganismer kolonisere^1,2.

Mange forskere studerer mikrobiell interaksjon å identifisere nye antimikrobielle molekyler. En av de første klinisk viktige antimikrobielle molekyler ble funnet gjennom studiet av mikrobielle interaksjoner. Sir Alexander Fleming observert en forurensende Penicillium spp. isolere som hemmet veksten av en Staphylococcus stamme, noe som førte til oppdagelsen av den brukte antibiotika penicillin³. Karakterisering av mekanismene som mikroorganismer bruker til å antagonize sine konkurrenter er fortsatt en fruktbar ressurs for oppdagelsen av antimikrobielle molekyler. For eksempel ble det nylig vist at Streptomyces Sp. stamme Mg1 produserer antibiotika linearmycins, som har en lytisk og degradative aktivitet mot Bacillus subtilis⁴.

Videre, en ikke-ribosomally syntetisert peptid navngitt lugdunin ble nylig oppdaget etter observasjon at nasal Commensal Staphylococcus Lugdunensis hemmer Staphylococcus aureus⁵. Studier har også vist at mutualistic interaksjoner mellom mikroorganismer er like kraftige som fiendtlige interaksjoner for oppdagelsen av antimikrobielle molekyler. For eksempel, mange sopp-oppdrett maur i stammen Attini Harbor symbiotisk bakterier kalt Pseudonocardia på deres Exoskeleton som produserer soppdrepende molekyler å hemme en forplikte patogen av sine fungal avling⁶. Som studiet av mikrobiell interaksjoner har vært fordelaktig for å oppdage antimikrobielle molekyler, bruk av høy gjennomstrømming skjermer kan resultere i oppdagelsen av nye antimikrobielle molekyler.

Med hensyn til kostnader og enkel ytelse, metodene som brukes til å studere mikrobielle interaksjoner spenner fra enkle til komplekse. For eksempel, en agar plugg analysen er en billig og enkel metode som kan brukes til å undersøke motsetningen mellom flere mikroorganismer⁷. Men en agar plugg analysen er ikke en effektiv prosedyre og kan være arbeidskrevende for mange parvis kombinasjoner. For å vurdere virkningene av mikrobielt produserte produkter på målet isolerer av interesse i en høy gjennomstrømming måte, mange laboratorier bruke disk diffusjon analyser⁸. Disse analysene er enkle og rimelige og kan skaleres til høyere antall prøver⁷. Men denne analysen krever generering av mikrobielle ekstrakter og kan produsere villedende resultater for visse kombinasjoner av mål organismer og antibiotika, for eksempel Salmonella og cefalosporiner⁹.

De foregående tilnærmingene er avhengige av isolerte komponenter for å lokke fram et svar i en mål organisme, i stedet for å la mikroorganismer samhandle med hverandre. Dette er av notatet fordi interaksjoner mellom mikrober kan lokke fram produksjonen av “kryptiske” antimikrobielle molekyler som ikke produseres i monokultur. For eksempel ble det nylig vist at den antimikrobielle keyicin er bare produsert av en Micromonospora Sp. Når co-kultivert med en Rhodococcus Sp. som er isolert fra samme svamp mikrobiomet¹⁰. Mer komplekse samspill metoder omgå dette potensialet monokultur hindring. For eksempel er iChip nyttig for å isolere sjeldne og vanskelige å dyrke bakterier fra miljø prøver og gir mulighet for observasjon av mikrobielle interaksjoner gjennom vekst in situ¹¹. Å etterforske vekselsvirkningene inne detaljen, matrise hjalp laser desorpsjon/ionisering tid-av-flyreise tenkelig masse massespektrometri (MALDI-TOF-IMS) kan brukes. Denne tilnærmingen gir detaljert informasjon om sammensetning og distribusjon av små molekyler og peptider som produseres ved å samhandle mikrobielle kolonier med høy romlig oppløsning. MALDI-TOF-IMS har også blitt brukt i flere studier av bakterielle interaksjoner å karakterisere mekanismene i konkurransen^12,13,14,15. Men MALDI-TOF-IMS krever ofte møysommelig prøve forberedelser, spesialisert ekspertise for å drive utstyret, og dyre og spesialiserte masse spektrometre. Av disse grunner er det en vanskelig teknikk å bruke for høy gjennomstrømming studier. Således, en enkel, skalerbar og høy gjennomstrømming co-kultur-analysen for mikrobiell interaksjoner som overvinner mange begrensninger av de ovennevnte tilnærminger vil være fordelaktig.

Her presenteres en protokoll for høy gjennomstrømning mikrobiell co-kultur. Denne analysen er enkel og lett innlemmet i eksisterende studier av mikrobielle interaksjoner. I motsetning til mange brukte metoder for studiet av mikrobielle interaksjoner, vår metode er enkel, billig, og er mottagelig for å undersøke et stort antall interaksjoner. Disse analysene er ikke bare enkle å utføre, men materialene er allment tilgjengelige fra de fleste laboratorie leverandører eller offentlige ressurser (for eksempel biblioteker og makerspaces). Følgelig er denne analysen fordelaktig som en første linje av etterforskning for å identifisere og analysere interessante mønstre blant mange parvis kombinasjoner av mikroorganismer, som kan være spesielt nyttig for etterforskningen av mikrobiell økologi.

Protocol

Informert samtykke ble innhentet fra donor foreldre, og Human Committee ved University of Wisconsin-Madison godkjent studien (institusjonelle Review Board [IRB] godkjenning nummer H-2013-1044). 1. sample kultur Merk: Denne prosedyren er brukt her for studiet av interaksjoner mellom bakterier isolerer fra den menneskelige nesehulen. I prinsippet er følgende metoder gjelder for enhver kultur tilstand. Brain-hjerte-infusjon buljong (BHI) brukes for gene…

Representative Results

Co-kultur samhandling analyser kan brukes til å forstå mikrobielle interaksjoner, identifisere mønstre av interesse, og avdekke mikrobielle isolerer med spennende aktiviteter. I disse analysene er en test organisme monocultured på den ene siden av en 12 brønn agar plate og inkubert i 7 dager. Deretter er en mål organisme observert ved siden av testen organisme og de to mikrober var co-kultivert for 7 dager før scoring for vekst fenotype av målet organisme. Analysene scores basert …

Discussion

Antibiotika og andre andre metabolitter som megle mikrobielle interaksjoner er nyttig for en rekke anvendelser, inkludert narkotika funn. Heri, en protokoll for co-kultur analyser for å vurdere et stort antall mikrobielle interaksjoner er presentert. Disse co-kultur samhandling analysene er en enkel, rimelig, skalerbar og høy gjennomstrømming betyr å undersøke mange parvis kombinasjoner av mikroorganismer i tandem. Target organismer er observert ved siden av test organismer i en brønn av en 12 brønn plate ved hjel…

Materials

1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue	VWR	12000-806
10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow	VWR	12000-810
12-well cell culture plate, sterile with lid	Greiner bio-one	665 180
14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile	Falcon	352057
2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile	USA scientific	1420-9710
25 mL serological pipet	Cell Treat	229225B
Agar, bacteriological	VWR	J637
Brain Heart Infusion Broth	Dot Scientific	DSB11000-5000
Polycarbonate filament, white, 3mm diameter	Keene Village Plastics	12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R
School Glue	Elmer's	EPIE304
Taz 6 3D printer	Lulzbot