Ensaios de co-cultura de alta produtividade para a investigação de interações microbianas
Summary
Os ensaios de interação cocultura apresentados neste protocolo são de baixo custo, alta taxa de transferência e simples. Esses ensaios podem ser usados para observar interações microbianas na cocultura, identificar padrões de interação e caracterizar o potencial inibitório de uma cepa microbiana de interesse contra patógenos humanos e ambientais.
Abstract
O estudo das interações entre microrganismos levou a inúmeras descobertas, desde novos antimicrobianos até insights em ecologia microbiana. Muitas abordagens utilizadas para o estudo das interações microbianas necessitam de equipamentos especializados e são dispendiosas e demoradas. Este artigo apresenta um protocolo para ensaios de interação de cocultura que são baratos, dimensionáveis para grandes números amostrais e facilmente adaptáveis a inúmeros experimentos experimentais. Os microrganismos são cultivados em conjunto, com cada poço representando uma combinação de microrganismos emparelhados. Um organismo de teste é cultivado em um lado de cada poço e primeiro incubado em monocultura. Subsequentemente, os organismos alvo são inoculados simultaneamente no lado oposto de cada poço, utilizando um carimbo de inoculação impresso em 3D. Após a cocultura, os ensaios concluídos são marcados para fenótipos visuais, como crescimento ou inibição. Esses ensaios podem ser usados para confirmar fenótipos ou identificar padrões entre isolados de interesse. Usando este método simples e eficaz, os usuários podem analisar combinações de microrganismos de forma rápida e eficiente. Esta aproximação da cocultura é aplicável à descoberta antibiótica assim como a pesquisa cultura-baseada do microbioma e foi aplicada já com sucesso a ambas as aplicações.
Introduction
Na natureza, os microrganismos raramente existem isoladamente; Consequentemente, eles estão constantemente interagindo com outros organismos. Portanto, estudar como os microrganismos interagem entre si é essencial para a compreensão de uma multiplicidade de comportamentos microbianos1. Interações microbianas podem ser mutualistas, comensais ou antagonistas. Estes em terações podem afetar não somente os micro-organismos eles mesmos mas também os ambientes e os anfitriões que os micro-organismos colonizam1,2.
Muitos cientistas estudam interações microbianas para identificar novas moléculas antimicrobianas. Uma das primeiras moléculas antimicrobianas clinicamente importantes foi encontrada através do estudo das interações microbianas. Sir Alexander Fleming observou um isolado contaminante de Penicillium spp. que inibiu o crescimento de uma cepa de Staphylococcus , o que levou à descoberta da penicilina antibiótica comumente utilizada3. A caracterização dos mecanismos que os microrganismos usam para antagonizar seus concorrentes continua a ser um recurso frutífero para a descoberta de moléculas antimicrobianas. Por exemplo, foi demonstrado recentemente que a estirpe de Streptomyces SP. Mg1 produz linearmicinas antibióticas, que têm uma atividade lítica e degradativa contra Bacillus subtilis4.
Mais, um peptide não-ribosomally sintetizado nomeado lugdunin foi descoberto recentemente após a observação que o Staphylococcus comensal nasal Lugdunensis inibe o Staphylococcus aureus5. Estudos também mostraram que interações mutualistas entre microrganismos são igualmente poderosas como interações antagônicas para a descoberta de moléculas antimicrobianas. Por exemplo, muitas formigas que cultivam fungos na tribo Attini abrigam bactérias simbióticas chamadas Pseudonocardia em seu exoesqueleto que produz moléculas antifúngicas para inibir um patógeno obrigatório de sua cultura fúngica6. Como o estudo das interações microbianas tem sido benéfico para a descoberta de moléculas antimicrobianas, o uso de telas de alta taxa de transferência pode resultar na descoberta de novas moléculas antimicrobianas.
Com relação ao custo e à facilidade de desempenho, as metodologias utilizadas para estudar interações microbianas variam de simples a complexas. Por exemplo, um teste de plugue de agar é um método barato e simples que pode ser usado para investigar o antagonismo entre múltiplos microrganismos7. No entanto, um ensaio de plugue de agar não é um procedimento eficiente e pode ser trabalhoso para muitas combinações emparelhadas. Para avaliar os efeitos de produtos microbialmente produzidos em isolados alvo de interesse de uma forma de alta produtividade, muitos laboratórios utilizam ensaios de difusão de disco8. Estes ensaios são fáceis e baratos e podem ser dimensionáveis para números mais elevados de amostras7. No entanto, este ensaio requer a geração de extratos microbianos e pode produzir resultados enganosos para certas combinações de organismos-alvo e antibióticos, tais como salmonelas e cefalosporinas9.
As abordagens anteriores dependem de componentes isolados para provocar uma resposta em um organismo alvo, em vez de permitir que os microrganismos interajam uns com os outros. Isso é de notar porque as interações entre os micróbios podem provocar a produção de moléculas antimicrobianas “crípticas” que não são produzidas em monocultura. Por exemplo, foi demonstrado recentemente que a keyicina antimicrobiana só é produzida por um Micromonospora SP. quando cocultivado com um Rhodococcus SP. que é isolado do mesmo microbioma de esponja10. Metodologias de interação mais complexas contornam esse potencial obstáculo à monocultura. Por exemplo, o iChip é útil para isolar bactérias raras e difíceis de cultivar de amostras ambientais e permite a observação de interações microbianas através do crescimento in situ11. Para investigar as interações em detalhe, a espectrometria de massa de imagem de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF-IMS) pode ser usada. Essa abordagem fornece informações detalhadas sobre a composição e distribuição de pequenas moléculas e peptídeos produzidos por colônias microbianas interagindo com alta resolução espacial. MALDI-TOF-IMS também tem sido utilizado em múltiplos estudos de interações bacterianas para caracterizar os mecanismos de competição12,13,14,15. No entanto, MALDI-TOF-IMS muitas vezes requer preparação de amostra trabalhoso, especialização especializada para operar o equipamento, e espectrómetros de massa caros e especializados. Por estas razões, é uma técnica difícil de usar para estudos de alta taxa de transferência. Assim, um ensaio de cocultura simples, escalável e de alta taxa de transferência para interações microbianas que supera muitas limitações das abordagens acima seria benéfico.
Aqui, um protocolo para a cocultura microbiana da taxa de transferência elevada é apresentado. Este ensaio é simples e facilmente incorporado em estudos pré-existentes de interações microbianas. Em contraste com muitos métodos comumente usados para o estudo de interações microbianas, nosso método é simples, barato, e é capaz de investigar um grande número de interações. Estes ensaios não são apenas fáceis de executar, mas os materiais estão amplamente disponíveis a partir da maioria dos fornecedores de laboratórios ou recursos públicos (por exemplo, bibliotecas e makerspaces). Consequentemente, este ensaio é vantajoso como uma primeira linha de investigação para identificar e analisar padrões interessantes entre muitas combinações emparelhadas de microrganismos, o que pode ser especialmente útil para a investigação da ecologia microbiana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antibióticos e outros metabólitos secundários que mediam interações microbianas são úteis para uma infinidade de aplicações, incluindo a descoberta de drogas. Neste documento, é apresentado um protocolo para ensaios de cocultura para avaliar um grande número de interações microbianas. Esses ensaios de interação de cocultura são um meio de throughput simples, acessível, escalável e de alta capacidade para investigar muitas combinações emparelhadas de microrganismos em tandem. Os organismos do alvo são…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Daniel May, Marc Chevrette e Don Hoang pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho, incluindo os esforços de Cameron R. Currie, foi apoiado pela Universidade de Wisconsin-Madison, gabinete do vice-chanceler de pesquisa e pós-graduação de educação com o financiamento da Wisconsin Alumni Research Foundation, financiamento também fornecido pelo Institutos nacionais de centros de saúde para a excelência da pesquisa translacional (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck foi apoiado por uma biblioteca nacional de medicina de formação de subvenção para a computação e informática em biologia e medicina programa de formação (NLM 5T15LM007359). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e interpretação, ou a decisão de submeter o trabalho para publicação.
Materials
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
References
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