Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri
Summary
Bu protokolde sunulan ortak kültür etkileşimi tahlilleri ucuz, yüksek iş ortası ve basittir. Bu tahliller, ortak kültürdeki mikrobiyal etkileşimleri gözlemlemek, etkileşim kalıplarını belirlemek ve insan ve çevresel patojenlere karşı mikrobiyal bir ilgi nin önleyici potansiyelini karakterize etmek için kullanılabilir.
Abstract
Mikroorganizmalar arasındaki etkileşimlerin incelenmesi, yeni antimikrobiyallerden mikrobiyal ekolojideki içgörülere kadar çok sayıda keşfe yol açmıştır. Mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesinde kullanılan birçok yaklaşım özel ekipman gerektirir ve pahalı ve zaman yoğundur. Bu makale, ucuz, büyük örnek sayılara ölçeklenebilir ve çok sayıda deneysel tasarımlara kolayca uyarlanabilen ortak kültür etkileşim idermeleri için bir protokol sunar. Mikroorganizmalar birlikte kültürlenir, her biri mikroorganizmaların bir çift taraflı kombinasyonunu temsil eder. Bir test organizması her kuyunun bir tarafında kültürlenir ve ilk olarak monokültürde kuluçkaya yatırılır. Daha sonra, hedef organizmalar aynı anda her kuyunun karşı tarafına 3D baskılı aşı damgası kullanılarak aşılanır. Ortak kültürden sonra, tamamlanan tahliller büyüme veya inhibisyon gibi görsel fenotipler için puanlandırılır. Bu tahliller fenotipleri onaylamak veya ilgi izole arasında desenleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu basit ve etkili yöntemi kullanarak, kullanıcılar mikroorganizmaların kombinasyonlarını hızlı ve verimli bir şekilde analiz edebilirler. Bu ortak kültür yaklaşımı antibiyotik keşfi nin yanı sıra kültür tabanlı mikrobiyom araştırmaları için de geçerlidir ve her iki uygulamaya da başarıyla uygulanmıştır.
Introduction
Doğada, mikroorganizmalar nadiren izole olarak bulunurlar; sonuç olarak, sürekli diğer organizmalar ile etkileşim vardır. Bu nedenle, mikroorganizmaların birbirleriyle nasıl etkileştiğini incelemek çok sayıda mikrobiyal davranışı anlamak için gereklidir1. Mikrobiyal etkileşimler karşılıklı, commensal veya antagonistik olabilir. Bu teractions sadece mikroorganizmaların kendilerini etkileyebilir ama aynı zamanda ortamlar ve barındıran mikroorganizmalar1,2kolonize .
Birçok bilim adamı yeni antimikrobiyal molekülleri tanımlamak için mikrobiyal etkileşimleri çalışma. Klinik olarak önemli ilk antimikrobiyal moleküllerden biri mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi ile bulunmuştur. Sir Alexander Fleming bir kontamine Penisilyum spp gözlenen bir Staphylococcus suşu büyümesini inhibe izole, hangi yaygın olarak kullanılan antibiyotik penisilin keşfine yol açtı3. Mikroorganizmaların rakiplerini kızdırmak için kullandıkları mekanizmaların karakterizasyonu antimikrobiyal moleküllerin keşfi için verimli bir kaynak olmaya devam etmektedir. Örneğin, son zamanlarda Streptomyces sp. suş Mg1 antibiyotik linearmycins üretir gösterilmiştir, Hangi Bacillus subtiliskarşı bir litik ve bozsal aktiviteye sahip4.
Ayrıca, non-ribozomally sentezlenmiş peptid lugdunin adlı son zamanlarda burun kommensal Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus aureusinhibe gözlem sonra keşfedildi5. Çalışmalar ayrıca mikroorganizmalar arasındaki karşılıklı etkileşimlerin antimikrobiyal moleküllerin keşfi için antagonistik etkileşimler kadar güçlü olduğunu göstermiştir. Örneğin, kabile Attini birçok mantar tarım karıncalar kendi mantar ürün zorunlu bir patojen inhibe etmek için antifungal molekülleri üreten dış iskelet üzerinde Pseudonocardia denilen simbiyotik bakteriler liman6. Mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi antimikrobiyal moleküllerin keşfi için yararlı olmuştur, yüksek iş elde ekranlarının kullanımı yeni antimikrobiyal moleküllerin keşfi ne neden olabilir.
Maliyet ve performans kolaylığı ile ilgili olarak, mikrobiyal etkileşimleri incelemek için kullanılan metodolojiler basitten komplekse kadar değişmektedir. Örneğin, bir agar fiş tsay birden fazla mikroorganizmalar arasında antagonizm araştırmak için kullanılabilecek ucuz ve basit bir yöntemdir7. Ancak, bir agar fiş teşp verimli bir prosedür değildir ve birçok çift yönlü kombinasyonları için emek yoğun olabilir. Mikrobiyal olarak üretilen ürünlerin yüksek iş akışı açısından hedef izolasyonlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için birçok laboratuvar 8diskdifüzyon tahlilleri kullanmalıdır. Bu tahliller kolay ve ucuzdur ve7. Ancak, bu tahnı mikrobiyal özlerin nesil gerektirir ve hedef organizmalar ve antibiyotiklerin belirli kombinasyonları için yanıltıcı sonuçlar üretebilir, Salmonella ve sefalosporinler gibi9.
Önceki yaklaşımlar, mikroorganizmaların birbirleriyle etkileşime girmesine izin vermek yerine, hedef organizmada bir tepki ortaya çıkarmak için izole bileşenlere dayanır. Mikroplar arasındaki etkileşimler monokültürde üretilmeyen “şifreli” antimikrobiyal moleküllerin üretimini ortaya çıkarmak olabilir, çünkü bu dikkat budur. Örneğin, son zamanlarda antimikrobiyal keyicin sadece bir Micromonospora sp tarafından üretilen gösterilmiştir. eş-aynı sünger mikrobiyom izole edilir bir Rhodococcus sp. ile kültürlü10. Daha karmaşık etkileşim metodolojileri bu potansiyel monokültür engelini aşar. Örneğin, iChip nadir ve zor çevresel örneklerden bakteri yetiştirmek için izole etmek için yararlıdır ve yerinde büyüme yoluyla mikrobiyal etkileşimlerin gözlem sağlar11. Etkileşimleri ayrıntılı olarak araştırmak için matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon zaman-of-flight görüntüleme kütle spektrometresi (MALDI-TOF-IMS) kullanılabilir. Bu yaklaşım, mikrobiyal kolonilerin yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip etkileşiminde bulunan küçük molekül ve peptidlerin bileşimi ve dağılımı hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. MALDI-TOF-IMS de rekabet mekanizmaları karakterize etmek için bakteriyel etkileşimleri birden fazla çalışmada kullanılmıştır12,13,14,15. Ancak, MALDI-TOF-IMS genellikle zahmetli numune hazırlama, ekipman çalıştırmak için özel uzmanlık ve pahalı ve özel kütle spektrometregerektirir. Bu nedenlerden dolayı, yüksek iş artışı çalışmaları için kullanımı zor bir tekniktir. Böylece, yukarıdaki yaklaşımların birçok sınırlamasını aşan mikrobiyal etkileşimler için basit, ölçeklenebilir ve yüksek iş ortağı ortak kültür tayini yararlı olacaktır.
Burada, yüksek iş artışı mikrobiyal co-kültür için bir protokol sunulmaktadır. Bu tetki basit ve kolayca mikrobiyal etkileşimler önceden varolan çalışmalara dahil edilmiştir. Mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi için yaygın olarak kullanılan birçok yöntemin aksine, yöntemimiz basit, ucuz ve çok sayıda etkileşimin araştırılmasıiçin uygundur. Bu tahlilleri gerçekleştirmek sadece kolay değil, aynı zamanda malzemelerin çoğu laboratuvar tedarikçisi veya kamu kaynaklarından (örn. kütüphaneler ve makerspaces) yaygın olarak mevcuttur. Sonuç olarak, bu araştırma, mikroorganizmaların birçok çift yönlü kombinasyonları arasında ilginç desenleri belirlemek ve ayrıştırmak için ilk araştırma satırı olarak avantajlıdır, mikrobiyal ekolojinin araştırılması nda özellikle yararlı olabilecek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antibiyotikler ve mikrobiyal etkileşimler aracılık diğer ikincil metabolitleri ilaç keşfi de dahil olmak üzere çok sayıda uygulama için yararlıdır. Burada, çok sayıda mikrobiyal etkileşimi değerlendirmek için ortak kültür tahlilleri için bir protokol sunulmuştur. Bu ortak kültür etkileşim iratları basit, uygun fiyatlı, ölçeklenebilir ve yüksek iş elde etme anlamına gelir, birlikte mikroorganizmaların birçok çift yönlü kombinasyonları araştırmak anlamına gelir. Hedef organizmalar, a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Daniel May, Marc Chevrette ve Don Hoang’a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Cameron R. Currie’nin çabaları da dahil olmak üzere bu çalışma, Wisconsin-Madison Üniversitesi, Araştırma ve Lisansüstü Eğitim Rektör Yardımcısı Ofisi tarafından Wisconsin Mezunlar Araştırma Vakfı’nın finansmanı ile desteklendi. Ulusal Sağlık Enstitüleri Çevirisel Araştırma Için Mükemmeliyet Merkezleri (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck Biyoloji ve Tıp Eğitim Programı (NLM 5T15LM007359) Hesaplama ve Enformatik eğitim hibe Tıp Milli Kütüphanesi tarafından desteklendi. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve yorumlama da veya çalışmayı yayına sunma kararında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
References
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234 (2016).
- Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).
- Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226 (1929).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11 (12), e1005722 (2015).
- Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).
- Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. , (2012).
- Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).
- Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
- Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).
- Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).
- Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).
- Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).
- Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10 (1), 516 (2019).
