يتم تقديم بروتوكول للكشف عن الخلايا السرطانية المبيضة المتداولة باستخدام نظام تدفق الصوتية التصويرية حسب العرف والمستهدفة النانويه كبريتيد النحاس المغطي بحمض الفوليك.
تشير العديد من الدراسات إلى ان تعداد الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) قد يظهر الوعد كاداه نذيره لسرطان المبيض. وتشمل الاستراتيجيات الحالية للكشف عن ctcs التدفق الخلوي ، والاجهزه ميكروفلويديك ، وفي الوقت الحقيقي تفاعل البلمره سلسله (RT-PCR). علي الرغم من التطورات الاخيره ، وأساليب للكشف عن سرطان المبيض المبكر الانبثاث لا تزال تفتقر إلى الحساسية والخصوصية المطلوبة للترجمة السريرية. هنا ، يتم تقديم طريقه جديده للكشف عن الخلايا السرطانية المنتشرة في المبيض عن طريق التدفق الصوتي الضوئي للخلايا (الاتحاد الاسيوي لكره القدم) باستخدام نظام طباعه ثلاثي الابعاد (3D) مخصص ، بما في ذلك غرفه التدفق ومضخة المحاقن. تستخدم هذه الطريقة جزيئات كبريتيد النحاس المغطية بحمض الفوليك لاستهداف خلايا سرطان المبيض من قبل الاتحاد الاسيوي للسرطان. يوضح هذا العمل تقارب عوامل التباين هذه لخلايا سرطان المبيض. تظهر النتائج توصيف NP ، والكشف عن الاتحاد الاسيوي لكره اليد ، وامتصاص NP عن طريق المجهر الفلوري ، مما يدل علي امكانيه هذا النظام الجديد للكشف عن CTCs المبيض في تركيزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
سرطان المبيض هو واحد من الأورام الخبيثة الامراض النسائية الأكثر فتكا ، وأسفرت عن وفيات يقدر 184,800 في جميع انحاء العالم في 20181. وقد أظهرت دراسات متعددة العلاقة بين تطور سرطان المبيض (اي, الانبثاث) ووجود ctcs2,3,4. الطريقة الأكثر شيوعا للكشف عن وعزل CTCs يستخدم نظام Cellsearch ، الذي يستهدف مستقبلات EpCam5. Epcam التعبير ، ومع ذلك ، هو دوونريجولاتيد في ظهاري للانتقال المستوي ، الذي كان متورطا في السرطان الانبثاث6. وعلي الرغم من التقدم المحرز ، لا تزال التكنولوجيات السريرية الحالية تعاني من انخفاض الدقة وارتفاع التكلفة والتعقيد. ونظرا لهذه العيوب ، أصبحت التكنولوجيات الجديدة لاكتشاف وتعداد CTCs المبيض مجالا هاما للبحوث.
في الاونه الاخيره ، برزت الاتحاد كطريقه فعاله للكشف عن الخلايا السرطانية غير الغازية ، وتحليل المواد النانويه ، وتحديد البكتيريا7،8،9. يختلف الاتحاد الاسيوي لكره اليد عن التدفق الخلوي التقليدي عن طريق الكشف عن التحاليل في التدفق باستخدام الصوتيات الضوئية. يتم إنشاء تاثير الصوتية الضوئية عندما يتم امتصاص ضوء الليزر من قبل المواد التي تسبب التمدد الحراري ، وإنتاج موجه الصوتية التي يمكن الكشف عنها بواسطة محول الموجات فوق الصوتية10،11. وتشمل مزايا الاتحاد علي أساليب التدفق الخلوي التقليدية البساطة ، وسهوله الترجمة إلى الإعدادات السريرية ، والكشف عن ctcs في أعماق لم يسبق لها مثيل في عينات المريض12،13. وقد استخدمت الدراسات الحديثة أنظمه الاتحاد للكشف عن الخلايا باستخدام التباين الداخلي والخارجي14،15. بالقرب من الاشعه تحت الحمراء (نير) وقد استخدمت عوامل التباين امتصاص الضوء مثل الصبغة الخضراء ، والمعادن NPs (مثل الذهب والجمارك) لوضع العلامات الانتقائية من الخلايا والانسجه في تركيبه مع التصوير الصوتي التصويري16،17،18. نظرا لتحسن عمق تغلغل ضوء نير داخل الانسجه البيولوجية ، يمكن اجراء الكشف الصوتي الضوئي لامتصاص في أعماق أكبر للتطبيقات السريرية. ونظرا لإمكاناتها الكبيرة للاستخدام في العيادة ، فان الجمع بين عوامل التباين المستهدفة مع الاتحاد الاسيوي لكره القد ولد اهتماما كبيرا بالكشف عن هذه التحويلات.
ويوفر الاتحاد بالاشتراك مع عوامل التباين المستهدفة نهجا محسنا للتحليل العالي الإنتاجي لعينات المريض بدقه معززه والكشف المستهدف لctcs. وتتمثل أحدي استراتيجيات الكشف الرئيسية لهذه التحويلات في الاستهداف المحدد للبروتينات الغشائية الموجودة في خليه الفائدة. واحده من السمات البارزة لctcs المبيض هو التعبير المفرط من مستقبلات حمض الفوليك الموجودة علي الغشاء الخارجي لها19. استهداف مستقبلات حمض الفوليك هو استراتيجية مثاليه لتحديد CTCs المبيض في الدم لان الخلايا الذاتية, التي لديها اعلي تعبير عن مستقبلات حمض الفوليك, عموما الاناره ولها التعرض محدوده لمجري الدم20. وقد تم مؤخرا التعرف علي كبريتيد النحاس NPs (CuS NPs) لقدرتها علي استهداف مستقبلات حمض الفوليك التي أعرب عنها في الخلايا السرطانية21. بالاضافه إلى توافقها الحيوي ، وسهوله التوليف ، والامتصاص العميق في تقرير الجرد العام ، فان عوامل التباين NP هذه تجعل استراتيجية الاستهداف المثالية للكشف عن CTCs المبيض باستخدام الاتحاد الاسيوي.
يصف هذا العمل اعداد الاتحاد العام لكره القد واستخدامها للكشف عن خلايا سرطان المبيض في نظام تدفق الصوتية الضوئية. يتم تعديل المصادر الخاصة بحمض الفوليك لاستهداف CTCs المبيض علي وجه التحديد وتنبعث منها اشاره صوتيه ضوئيه عند تحفيزها باستخدام ليزر 1,053 nm. تشير النتائج إلى الاكتشاف الناجح لخلايا سرطان المبيض التي تم احتضانها باستخدام عوامل التباين الصوتية الضوئية داخل نظام الاتحاد الاسيوي للسرطان. تظهر هذه النتائج الكشف عن خلايا سرطان المبيض وصولا إلى تركيزات 1 خليه/μL ، والمجهر الفلوري يؤكد الامتصاص الناجح لهذه الجزيئات من قبل الخلايا السرطانية المبيضية-3 المبيض22. يوفر هذا العمل وصفا مفصلا لتوليف الاتحاد النقدي الخاص-CuS إلى NPs ، واعداد عينات لفحص المجهر الفلوري ، وبناء نظام التدفق الصوتي الضوئي ، والكشف الصوتي الضوئي لخلايا سرطان المبيض. تظهر الطريقة المعروضة التعرف الناجح علي CTCs المبيض في التدفق باستخدام الاتحاد النقدي الخاص-CuS إلى NPs. وسوف تركز الاعمال المستقبلية علي التطبيق السريري لهذه التكنولوجيا نحو الكشف المبكر عن سرطان المبيض الانبثاث.
هذا البروتوكول هو وسيله واضحة للكشف عن CTCs المبيض باستخدام الاتحاد الاسيوي لكره القد وعامل التباين المستهدفة CuS. وقد تم استكشاف العديد من الطرق للكشف عن ctcs المبيض ، بما في ذلك الاجهزه ميكروفلويديك ، RT-PCR ، والفلوري تدفق الخلوي23،24،25. هذه الم…
The authors have nothing to disclose.
ويود المؤلفون ان يعترفوا بمادلين هاويل لمساعدتها في التوليف ، ماثيو الصدر لمساعدته في تصميم نظام تدفق ، وإيثان Marschall للحصول علي المساعدة مع سوليدووركس.
0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
3D Printed Tank | Custom-made | ||
Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
Trypan Blue Solution .4% | Amresco | K940-100ML | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |