Biomechanische Prüfung von Murine tendons
Summary
Das Protokoll beschreibt effiziente und reproduzierbare zahnfeste biomechanische Prüfverfahren für murine Sehnen durch die Verwendung von kundenspezifischen 3D-gedruckten Vorrichtungen.
Abstract
Sehnenerkrankungen sind häufig, betreffen Menschen jeden Alters und sind oft schwächend. Standardbehandlungen, wie entzündungshemmende Medikamente, Rehabilitation und chirurgische Reparatur, scheitern oft. Um die Sehnenfunktion zu definieren und die Wirksamkeit neuer Behandlungen nachzuweisen, müssen die mechanischen Eigenschaften von Sehnen aus Tiermodellen genau bestimmt werden. Murine Tiermodelle sind heute weit verbreitet, um Sehnenerkrankungen zu studieren und neuartige Behandlungen für Tendinopathien zu bewerten; Die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften von Maussehnen war jedoch eine Herausforderung. In dieser Studie wurde ein neues System für die mechanische Nehneprüfung entwickelt, das 3D-gedruckte Vorrichtungen enthält, die genau mit den Anatomien des Humerus und calcaneus übereinstimmen, um supraspinatus Sehnen bzw. Achillessehnen mechanisch zu testen. Diese Vorrichtungen wurden mit 3D-Rekonstruktionen der nativen Knochenanatomie, Feststoffmodellierung und additiver Fertigung entwickelt. Der neue Ansatz eliminierte artefaktische Greiffehler (z. B. Versagen am Ausfall der Wachstumsplatte anstelle der Sehne), verringerte die Gesamttestzeit und erhöhte Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ist diese neue Methode leicht anpassbar, um andere murine Sehnen und Sehnen von anderen Tieren zu testen.
Introduction
Sehnenerkrankungen sind häufig und weit verbreitet unter den alternden, athletischen und aktiven Populationen1,2,3. In den Vereinigten Staaten werden jährlich 16,4 Millionen Bindegewebsverletzungen gemeldet4 und machen 30 % aller verletzungsbedingten Arztbesuche3,5,6,7, 8. Die am häufigsten betroffenen Stellen sind die Rotatormanschette, Achillessehne und Patellasehne9. Obwohl eine Vielzahl von nicht-operativen und operativen Behandlungen erforscht wurden, einschließlich entzündungshemmender Medikamente, Rehabilitation und chirurgische Reparatur, die Ergebnisse bleiben schlecht, mit begrenzter Rückkehr zur Funktion und hohe Ausfallraten5, 6. Diese schlechten klinischen Ergebnisse haben grundlegende und translationale Studien motiviert, die darauf abzielen, die Teninopathie zu verstehen und neue Behandlungsansätze zu entwickeln.
Zug-biomechanische Eigenschaften sind die primären quantitativen Ergebnisse, die die Sehnenfunktion definieren. Daher muss die Laborcharakterisierung der Tendinopathie und die Wirksamkeit der Behandlung eine strenge Prüfung der Sehnenzugeigenschaften umfassen. Zahlreiche Studien haben Methoden beschrieben, um die biomechanischen Eigenschaften von Sehnen von Tiermodellen wie Ratten, Schafe, Hunde und Kaninchen10,11,12zu bestimmen. Jedoch, wenige Studien haben die biomechanischen Eigenschaften der murinen Sehnen getestet, vor allem aufgrund der Schwierigkeiten beim Greifen der kleinen Gewebe für Zugtests. Da murine Modelle zahlreiche Vorteile für die mechanistische Untersuchung der Tendinopathie haben, einschließlich genetischer Manipulation, umfangreiche Reagenzoptionen und kostengünstiger Kosten, ist die Entwicklung präziser und effizienter Methoden zur biomechanischen Prüfung von murinen Geweben erforderlich.
Um die mechanischen Eigenschaften von Sehnen richtig zu testen, muss das Gewebe effektiv gegriffen werden, ohne zu rutschen oder Artefakt an der Griffschnittstelle zu reißen oder die Wachstumsplatte zu zerbrechen. In vielen Fällen, insbesondere bei kurzen Sehnen, wird der Knochen an einem Ende und die Sehne am anderen Ende gegriffen. Knochen werden in der Regel durch Einbettung in Materialien wie Epoxidharz13 und Polymethylmethacrylat14,15gesichert. Sehnen werden oft zwischen zwei Schichten Schleifpapier platziert, mit Cyanoacrylat geklebt und mit Kompressionsklemmen gesichert (wenn der Querschnitt flach ist) oder in einem gefrorenen Medium (wenn der Querschnitt groß ist)15,16,17 . Diese Methoden wurden auf biomechanisch getestetmurine Sehnen angewendet, aber Herausforderungen entstehen aufgrund der geringen Größe der Proben und der Übereinstimmung der Wachstumsplatte, die nie ossifies18. Zum Beispiel beträgt der Durchmesser des murinen Humeralkopfes nur wenige Millimeter, was das Greifen des Knochens erschwert. Insbesondere führt die Zugprüfung von murinen supraspinatus Sehnen-Knochen-Proben oft zu einem Versagen an der Wachstumsplatte und nicht an der Sehne oder an der Sehnenenenthese. Ebenso ist die biomechanische Prüfung der Achillessehne eine Herausforderung. Obwohl die Achillessehne größer ist als andere murine Sehnen, ist der Calcaneus klein, was das Greifen dieses Knochens erschwert. Der Knochen kann entfernt werden, gefolgt von Greifer der beiden Sehnenenden; Dies schließt jedoch die Prüfung der Sehnen-Knochen-Befestigung aus. Andere Gruppen berichten, dass der Kalkknochen mit maßgefertigten Vorrichtungen19,20, Verankerung durch Klemmen21, Fixierung in selbsthärtenden Kunststoffzement22 oder mit einem konischen Formschlitz22, aber diese Frühere Methoden bleiben durch geringe Reproduzierbarkeit, hohe Greiffehlerraten und mühsame Vorbereitungsanforderungen begrenzt.
Ziel der aktuellen Studie war es, eine genaue und effiziente Methode zur zugfesten biomechanischen Prüfung von murinen Sehnen zu entwickeln, wobei der Schwerpunkt auf den Supraspinatus- und Achillessehnen als Beispiel lag. Mit einer Kombination aus 3D-Rekonstruktionen aus nativer Knochenanatomie, Solid-Modellierung und additiver Fertigung wurde eine neuartige Methode entwickelt, um die Knochen zu greifen. Diese Vorrichtungen sicherten effektiv die Knochen, verhinderten Wachstumsplattenversagen, verkürzten die Probenvorbereitungszeit und erhöhten die Reproduzierbarkeit der Tests. Die neue Methode ist leicht anpassbar, um andere murine Sehnen sowie Sehnen bei Ratten und anderen Tieren zu testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine Tiermodelle werden häufig verwendet, um Sehnenstörungen zu studieren, aber die Charakterisierung ihrer mechanischen Eigenschaften ist eine Herausforderung und in der Literatur ungewöhnlich. Der Zweck dieses Protokolls ist es, eine zeiteffiziente und reproduzierbare Methode zur Zugprüfung von murinen Sehnen zu beschreiben. Die neuen Methoden reduzierten die Zeit, die zum Testen einer Probe erforderlich war, von Stunden auf Minuten und eliminierten ein wichtiges Greifartefakt, das in früheren Methoden ein häuf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde vom NIH / NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836) unterstützt.
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose |
| Bruker microCT | Bruker BioSpin Corp | Skyscan 1272 | Used by authors |
| ElectroForce | TA Instruments | 3200 | Testing platform |
| Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% and use as suggested in protocol |
| Fixture to attach grips | Custom made | Used by authors | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | S-8115 | As suggested in protocol |
| MicroCT CT-Analyser (Ctan) | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| MilliQ water (Ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | 100 ml |
| Meshmixer | Autodesk | http://www.meshmixer.com/ | Free engineering software used by authors to refine mesh |
| Objet EDEN 260VS | Stratasys LTD | Precision Prototyping | |
| Objet Studio | Stratasys LTD | Used by authors with 3D printer | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010031 | 2.5 L of 10% PBS |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | Used by authors |
| Scalpel Blade – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | Used by authors |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Used by authors |
| SkyScan 1272 | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| Skyscan CT-Vox | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SkyScan NRecon | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SolidWorks CAD | Dassault Systèmes | SolidWorks Research Subsription | Solid modeling computer-aided design used by authors |
| SuperGlue | Loctite | 234790 | As suggested in protocol |
| Testing bath | Custom made | Used by authors | |
| Thin film grips | Custom made | Used by authors | |
| VeroWhitePlus | Stratasys LTD | NA | 3D printing material used by authors |
| WinTest | WinTest Software | Used by authors to collect data |
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