푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석
Summary
이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.
Abstract
다세포 유기체 내에서, 성숙한 조직 및 기관은 그들의 구성 세포의 공간 배열에 순서의 높은 학위를 표시합니다. 놀라운 예는 동일하거나 명백한 정체성의 세포가 고도로 조직된 평면 패턴을 보여주는 세포 세포 접착을 통해 함께 모이는 감각 에피텔리아에 의해 주어집니다. 셀은 동일한 방향으로 서로 정렬하고 큰 거리에서 동등한 극성을 표시합니다. 성숙한 상피의이 조직은 형태 형성의 과정을 통해 확립됩니다. 성숙한 상피의 평면 배열이 달성되는 방법을 이해하기 위하여는, 생체 내에서 발달 도중 높은 주시부 충실도를 가진 세포 배향 그리고 성장 역학을 추적하는 것이 중요합니다. 또한 로컬-글로벌 전환을 식별하고 특성화하는 데 강력한 분석 도구도 필수적입니다. Drosophila pupa는 상피 형태 형성의 근본적인 지향성 세포 모양 변경을 평가하는 이상적인 시스템입니다. pupal 개발 상피는 움직이지 않는 바디의 외부 표면을 구성합니다, 손상되지 않은 동물의 장기 적인 화상 진찰을 허용하. 여기에서 기술된 프로토콜은 퍼팔 복부 표피에 있는 글로벌 그리고 현지 수준 둘 다에 있는 세포 행동을 심상하고 분석하기 위하여 디자인됩니다. 기술된 방법론은 그밖 발달 단계, 조직, 세포이하 구조물, 또는 모형 유기체에 세포 행동의 화상 진찰에 쉽게 적응될 수 있습니다.
Introduction
그들의 역할을 달성하기 위해 상피 조직은 세포 구성 요소의 공간 조직에 완전히 의존합니다. 대부분의 에피텔리아에서 세포는 정확한 조약돌 층을 만들기 위해 서로 에피테일뿐만 아니라 신체 축을 기준으로 방향을 조정합니다.
정확한 조직 조직의 기능적 중요성은 척추 동물 내이및 망막과 같은 감각 상피에서 명백합니다. 첫 번째 경우, 머리카락과 지지 셀은 특정 축 방향으로 정렬되어 소리 및 동작1,,2와같은 기계적 입력을 효율적으로 감지합니다. 유사하게, 광수용체 세포 공간 조직은 망막3에의해 최적의 광학 적 특성을 달성하기 위해 필수적이다. 세포 위치 및 방향의 공간 제어는 따라서 적절한 생리 기능에 대한 특정 관련성이다.
Drosophila는 변형을 통해 애벌레 신체 구조의 완전한 변형을 겪는 홀로 메타 볼곤충으로 성인 조직을 초래합니다. Drosophila pupa는 발달 세포 이동4,세포 분열 및 성장 역학5,근육 수축6,세포 사멸7,상처 수리8,세포 방향9등 다양한 동적 사건의 비침습적 라이브 이미징을 위한 우수한 모델이다. 성인 초파리에서외부 상피는 높은 수준의 질서를 보여줍니다. 이것은 쉽게 상피 (즉, 단일 상피 세포에서 유래 세포 돌출)와 비행의 신체 표면(10)에걸쳐 감각 강모의 배열에 관찰된다. 실제로, 허집은 공기 흐름을 안내 병렬 행에정렬된다 11. 성인 에피탈리아의 형태 형성과 개별 세포의 정렬 된 배열은 배아 발생 중에 시작되고 pupal 단계 동안 절정을 이룬다. 배아 세포 분열에서, intercalations 및 모양은 모두 감소 조직 순서12,,13,이것은 개발의 나중 단계에서, 특히 푸팔 단계에서, 비행이 성숙에 접근할 때9.
움직이지 않는 초파리 퍼프는 세포 모양과 배향 변화를 평가하는 이상적인 시스템을 제공합니다. pupal 복부 표피는 특별한 이점을 제시합니다. 성인 머리, 흉부, 생식기 및 부속기의 전구체가 자라고 애벌레 단계에서 패턴화되는 동안, 애벌레 표피에 통합된 히스토블라스트는14번에서만 성장하고 분화하기 시작한다. 이 기능은 전체9에서조직 질서의 확립에 관련된 모든 시공간적 사건을 추적 할 수 있습니다.
조직 폭발은 각 추정 복부 세그먼트에 있는 반대 측 위치에 배아 발달 도중 지정됩니다. 성인의 등쪽 복부 표피는 전방 및 후방 구획에 존재하는 등측에 위치한 히스토블라스트둥지로부터 유래15,,16. 히스토블라스트가 팽창함에 따라, 애벌레 상피 세포(LECs)를 대체하며, 상반된 둥지는 등쪽 중간선에서 융합되어17,,18,,19,,20을형성한다.
이 작품은 1) Drosophila pupae의 해부, 장착 및 장기 라이브 이미징을위한 방법론, 2) 높은 주분체 해상도에서 세포 배향 및 성장의 역학을 연구하는 분석 방법을 설명합니다. 상세한 프로토콜은 초기 pupae 준비 (즉, 준비 및 이미징)에서 방향성 및 방향 기능의 추출 및 정량화에 필요한 모든 단계를 포함하는 여기에 제공됩니다. 우리는 또한 세포 클론의 분석에서 국소 조직 특성을 추론하는 방법을 설명합니다. 설명된 모든 단계는 최소 침습적이며 장기 적인 라이브 분석을 허용합니다. 여기에 설명된 방법은 다른 발달 단계, 조직 또는 모델 유기체에 쉽게 적응하고 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
장거리 주문은 대부분의 기능성 생리학적 단위의 필수 특성입니다. 형태 형성 동안, 순서는 높은 시간 및 공간 정밀도로 구현 된 복잡한 명령의 통합을 통해 달성된다. 다중 및 다단계 구속은 스테레오타입 조직 배열로 통합됩니다.
극성과 지향성은 개발 중에 정렬된 공간 배열에 매우 중요합니다. 극성은 개발 중에 대칭 파괴를 의미합니다. 비대칭의 성취는 배아 전방 후방 (A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움이 토론에 대한 마틴 – 블랑코 연구소의 회원들에게 감사드립니다. 우리는 또한 닉 타폰 (크릭 연구소, 런던, 영국), 블루밍턴 스톡 센터 (인디애나 대학, 미국) 및 FlyBase (초파리 유전자 별표)에 감사드립니다. 페데리카 만지오네는 JAE-CSIC 박사 전 펠로우십의 지원을 받았습니다. 마르틴-블랑코 연구소는 프로그램 아토타 에스타탈 드 포멘토 드 라 인베스티가시온 Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P 및 BFU2017-82876-P)와 Fundación 라몬 아레세스로부터 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
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