समय चूक लाइव इमेजिंग और फास्ट डेन्ड्रिटिक शाखा गतिशीलता के क्वांटिफिकेशन Drosophila न्यूरोन के विकास में
Summary
यहाँ, हम विधि हम Drosophila लार्वा मस्तिष्क की एक जीवित तैयारी में अत्यधिक गतिशील डेन्ड्रिटिक filopodia छवि के लिए कार्यरत का वर्णन है, और प्रोटोकॉल हम dendrite के मात्रात्मक आकलन के लिए समय चूक 3 डी इमेजिंग डेटासेट की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित न्यूरॉन्स के विकास में गतिशीलता.
Abstract
अत्यधिक गतिशील डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया प्रारंभिक विकास चरणों में न्यूरॉन्स में व्यापक रूप से मौजूद हैं। ये अन्वेषणात्मक गतिशील शाखाएं आस-पास के वातावरण का नमूना देती हैं और संभावित synaptic भागीदारों के साथ संपर्क आरंभ करती हैं। हालांकि डेन्ड्रिटिक शाखा गतिशीलता और synaptogenesis के बीच संबंध अच्छी तरह से स्थापित है, कैसे विकास और गतिविधि पर निर्भर प्रक्रियाओं डेन्ड्रिटिक शाखा गतिशीलता को विनियमित अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहा है. यह आंशिक रूप से इन ठीक संरचनाओं के लाइव इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के साथ जुड़े तकनीकी कठिनाइयों के कारण है एक में vivo प्रणाली का उपयोग कर. हम Drosophila लार्वा अधर पार्श्व न्यूरॉन्स (LNvs), जो व्यक्तिगत आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग कर लेबल किया जा सकता है और लाइव इमेजिंग के लिए सुलभ हैं का उपयोग कर डेन्ड्राइट गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक विधि की स्थापना की। इस प्रणाली का लाभ उठाते हुए, हमने समय चूक लाइव इमेजिंग के माध्यम से एक एकल लेबल वाले एलएनवी के पूरे डेन्ड्रिटिक आर्बर की शाखा गतिशीलता को पकड़ने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं। हम तो बहाव सुधार और deconvolution के माध्यम से छवि की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए पोस्ट प्रसंस्करण प्रदर्शन किया, सभी शाखा टर्मिनलों के स्थानिक पदों annotating द्वारा एकल शाखा स्तर पर शाखा गतिशीलता का विश्लेषण करके पीछा किया। अंत में, हमने टर्मिनल अनुरेखण द्वारा उत्पन्न निर्देशांक सूचना का उपयोग करके शाखा गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए आर स्क्रिप्ट(पूरक फाइल) और विशिष्ट पैरामीटर विकसित किए। सामूहिक रूप से, इस प्रोटोकॉल हमें उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ न्यूरॉन डेन्ड्रिटिक वृक्ष की शाखा गतिशीलता की एक विस्तृत मात्रात्मक विवरण प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है. हमारे द्वारा विकसित की गई विधियाँ आम तौर पर इन विट्रो और विवो स्थितियों दोनों में विरल लेबल न्यूरॉन्स पर लागू होती हैं।
Introduction
Dendrites विशेष न्यूरोनल डिब्बों कि प्राप्त करते हैं और संवेदी और synaptic इनपुट प्रक्रिया कर रहे हैं. डेन्ड्रिटिक आर्बोर्स की जटिल और रूढ़ संरचना की खोज के बाद से गहन जांच की जा रही है। डीओसोफिला प्रणाली में Xenopus ऑप्टिक tectal न्यूरॉन्स, चिक रेटिना गुच्छिका कोशिकाओं, और डेन्ड्रिटिक arborization (डा) न्यूरॉन्स सहित मॉडल सिस्टम की एक संख्या, विकास का अध्ययन करने के लिए स्थापित किया गया है, remodeling और प्लास्टिक की तंत्रिका डेंड्राइट1,2,3,4. Drosophila अधर पार्श्व न्यूरॉन्स (LNvs) दृश्य प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के एक समूह शुरू में मक्खी व्यवहार के circadian विनियमन में अपने महत्वपूर्ण कार्यों के लिए पहचान कर रहे हैं5. अध्ययनों से यह भी पता चला है कि लार्वा फोटोरिसेप्टर्स (पीआर)6,7के प्रत्यक्ष पदों के लक्ष्य के रूप में लार्वा LNvs की भूमिका का पता चला है . महत्वपूर्ण बात यह है कि विभिन्न प्रकाश व्यवस्थाओं में लार्वा विकसित करने से एलएनवीएस के डेन्ड्रिटिक आर्बोजरों के आकार पर दृढ़ता से प्रभाव पड़ता है, जो डेन्ड्रिटिक प्लास्टिक7के अध्ययन के लिए एक नए मॉडल के रूप में एलएनवी एस की उपयुक्तता का प्रदर्शन करता है। हमारे समूह के हाल के कार्य से यह भी पता चलता है कि एलएनवी डेन्ड्राइट का आकार और डेन्ड्रिटिक शाखाओं का गतिशील व्यवहार अनुभव पर निर्भरप्लास्टिक8,9 को प्रदर्शित करताहै। इस काम के भाग के रूप में, हमने 2एन डी या 3rd इनस्टार लार्वा से LNvs की डेन्ड्राइट गतिशीलता पर विश्लेषण करने के लिए एक नया लाइव इमेजिंग और परिमाणीकरण प्रोटोकॉल विकसित किया है।
Drosophila लार्वा मस्तिष्क की पारदर्शी प्रकृति यह लाइव इमेजिंग के लिए आदर्श बनाता है. तथापि, एलएनव्स के डेन्ड्रिटिक वृक्ष लार्वा ब्रेन लोब6के केंद्र में घनी आंतरिक लार्वा ऑप्टिक न्यूरोपिल (लंदन) में स्थित हैं। बरकरार मस्तिष्क के ऊतकों में ठीक डेन्ड्रेट शाखाओं और filopodia की छवियों पर कब्जा करने के लिए, हम दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी का उपयोग, जो प्रकाश प्रवेश की गहराई बढ़ जाती है और लाइव इमेजिंग प्रयोगों के दौरान phototoxicity कम कर देता है10. इस सेटअप का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक न्यूरॉन के स्पष्ट रूपात्मक गिरावट को देख के बिना 30 मिनट से अधिक के लिए LNvs पर लाइव इमेजिंग प्रयोगों का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, फ्लिप-आउट तकनीक का उपयोग आनुवंशिक जोड़तोड़ हमें एक झिल्ली टैग GFP के साथ व्यक्तिगत LNvs लेबल करने के लिए सक्षम है, जो भी व्यक्तिगत शाखाओं के आंदोलनों की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है11,12,13 .
इष्टतम ऑप्टिक संकल्प के साथ LNv डेन्ड्रिटिक वृक्ष पर सभी शाखाओं के गतिशील व्यवहार पर कब्जा करने के लिए, हम नए सिरे से विच्छेदन लार्वा मस्तिष्क explants पर समय चूक 3 डी इमेजिंग प्रदर्शन किया 10 से 30 मिनट के लिए फ्रेम प्रति 1 मिनट पर एक उच्च स्थानिक संकल्प के साथ LNv. LNv का विकास dendrites अत्यधिक गतिशील हैं, शाखाओं का एक बड़ा प्रतिशत के साथ 10 मिनट खिड़की के भीतर प्रेक्षणीय परिवर्तन प्रदर्शित. यह dendrite गतिशीलता का अध्ययन करने में मुख्य तकनीकी चुनौतियों में से एक की ओर जाता है, 4D छवि डेटा सेट के आधार पर शाखा व्यवहार की मात्रा निर्धारित. पहले स्थापित तरीकों सटीकता और अत्यधिक समय की आवश्यकता की कमी सहित विभिन्न सीमाएं हैं। इसलिए, हमने एक अर्द्ध-स्वचालित विधि विकसित की है जो छवि के बाद प्रसंस्करण, शाखा टर्मिनलों के मैनुअल अंकन, और एक छवि एनोटेशन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्वचालित 4D स्पॉट ट्रेसिंग को जोड़ती है। हम स्थानों के 3 डी निर्देशांक के आधार पर अलग अलग समय बिंदुओं पर शाखा टर्मिनलों के आंदोलनों की गणना. डेटा तो निर्यात और शाखा गतिशीलता की मात्रात्मक माप का उत्पादन करने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. इस विधि सही अवधि और मौजूदा शाखाओं के विस्तार और वापसी की घटनाओं की सीमा का आकलन, साथ ही नई शाखाओं के गठन, हमें न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या में dendrite गतिशीलता की निगरानी करने के लिए अनुमति देता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल हम रिकॉर्ड और Drosophila लार्वा दिमाग में व्यक्तिगत रूप से लेबल न्यूरॉन्स में डेन्ड्रिटिक शाखाओं के गतिशील व्यवहार की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित का वर्णन. विशेष रूप से, हमा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह कार्य राष्ट्रीय तंत्रिका संबंधी विकार और स्ट्रोक संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के इंट्रामरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित है। परियोजना संख्या 1$IANS003137.
Materials
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| high vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES | |||
References
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