여기에서는 Drosophila 애벌레 뇌의 실시간 준비에서 매우 운동성 수지상 필로포디아를 이미지화하기 위해 사용한 방법과 수상돌기의 정량적 평가를 위해 시간 경과 3D 이미징 데이터 세트를 정량화하기 위해 개발한 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 개발에 역학.
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이 논문에서
요약
초록
고도의 운동성 수지상 필로포디아는 초기 발달 단계에서 뉴런에 널리 존재합니다. 이러한 탐색 동적 분기 주변 환경을 샘플링 하 고 잠재적인 시 냅 스 파트너와 접촉을 시작. 수지상 분지 역학과 시냅토 발생 사이의 연결이 잘 확립되어 있지만, 개발 및 활동 의존적 인 프로세스가 수지상 분기 역학을 조절하는 방법은 잘 이해되지 않습니다. 이것은 부분적으로 생체 내 시스템을 사용하여 이러한 미세 구조의 라이브 이미징 및 정량적 분석과 관련된 기술적 어려움에 기인한다. 우리는 개별적으로 유전 접근을 사용하여 표지될 수 있고 살아있는 화상 진찰을 위해 접근할 수 있는 Drosophila 애벌레 복부 측삭 신경세포 (LNvs)를 사용하여 수상돌기 역학을 공부하는 방법을 설치했습니다. 이 시스템을 활용하여 타임랩스 라이브 이미징을 통해 단일 라벨이 부착된 LNv의 전체 수지상 아버의 분기 역학을 포착하는 프로토콜을 개발했습니다. 그런 다음 드리프트 보정 및 디톤볼루션을 통해 이미지 품질을 개선하기 위해 후처리를 수행한 다음 모든 분기 단말의 공간 위치에 별칭을 하여 단일 분기 수준에서 분기 역학을 분석했습니다. 마지막으로 터미널 추적에 의해 생성된 좌표 정보를 사용하여 분기 역학을 정량화하기 위해 R스크립트(보충 파일)및 특정 매개 변수를 개발했습니다. 전체적으로, 이 프로토콜은 우리가 높은 시간및 공간 적 분해능을 가진 신경 수지상 아버의 가지 역학의 상세한 정량적 설명을 달성할 수 있게 한다. 우리가 개발 한 방법은 일반적으로 시험관 내 및 생체 내 조건 모두에서 드물게 표지 된 뉴런에 적용 할 수 있습니다.
서론
수상돌기는 감각및 시냅스 입력을 수신하고 처리하는 특수 신경 구획입니다. 수지상 아버의 복잡하고 고정 된 구조는 발견 이후 강도 높은 조사를 받고 있습니다. 제노푸스 광학 지각 신경세포, 병아리 망막 신경절 세포, 초파리 시스템의 수지상 수공(da) 뉴런을 포함한 다수의 모델 시스템이 개발, 리모델링 및 가소성을 연구하기 위해 설립되었습니다. 신경 모수석1,2,3,4. Drosophila 복부 측측 뉴런 (LNvs)은 비행 행동의 circadian 규칙에 있는 그들의 중요한 기능을 위해 처음에 확인된 시각적 투영 뉴런의 단5. 연구는 또한 애벌레 광수용체 (P)6,7의직접적인 후발성 표적으로 애벌레 LNvs의 역할을 밝혔다. 중요한 것은, 다른 빛 정권에서 개발 애벌레를 배양하는 것은 강하게 수지상 가소성 연구를위한 새로운 모델로 LNvs의 적합성을 입증, LNvs의 크기....
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프로토콜
주의 사항: 이 프로토콜은 클래스 IV 레이저의 사용을 포함하고 적절한 교육 및 안전 지침을 따라야합니다. 직접 또는 산란된 레이저 광에 눈이나 피부에 노출되지 않도록 하십시오.
참고: 프로토콜에는 6단계가 포함되어 있습니다. 워크플로는 그림 1A에표시됩니다.
1. 플립 아웃 기술을 사용하여 개별 뉴런에 라벨링
참고: LNvs의 단일 라벨링은 플리타제-매개 형루 라벨링을 사용하여 단일 LNvs에서 mCD8::GFP를 표현함으로써 달성됩니다. 플라이 라인의 유전자형은 다음과 같은 것입니다. PDF-갈4; UAS-FRT-CD2-스톱-FRT-mCD8::GFP11,12,13. 단일 라벨이 부착된 LNv를 얻는 빈도는 약 10%입니다. 플라이 스톡은 일주기 및 습도 제어 25°C 인큐베이터에서 표준 매체로 유지됩니다.
- 효모 보....
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결과
위에서 설명한 라이브 이미징 프로토콜을 사용하여 후속 분석 및 정량화를 위해 고해상도 이미지 스택을 캡처합니다. 보조 비디오 1은 LNv. 도 2B가 개별적으로 라벨이 붙은 대표적인 로부터 수집된 최대 강도 투영(MIP) 이미지 시리즈를 도시하며, 이미지 시리즈의 8프레임에 상응하는 몽타주를 나타낸다. 두 패널에서 화살촉은 철회 이벤트를 표시하고 화살표는 확장 이벤트를 표시합니다.
다음으로, 우리는 이미지 분석 소프트웨어(재료표)를사용하여 지점 단자의 반자동 4D 추적을 수행합니다. 그림 3 B는 LNv라는 대표자로부터 동적 분기 단자의 .......
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토론
여기에서, 우리는 우리가 기록하고 Drosophila 애벌레 두뇌에 있는 개별적으로 표지된 뉴런에 있는 수지상 가지의 동적 행동을 정량화하기 위하여 개발한 프로토콜을 기술합니다. 특히, 우리의 라이브 이미징 프로토콜은 우리가 애벌레 LNv의 전체 수지상 아버를 캡처하고 그 수상 돌기 지점의 동적 상태의 글로벌 뷰를 제공 할 수 있도록 특정 매개 변수를 포함하고 있습니다. 그러나, 우리의 정량화 방법은 분지 말단의 부현에 크게 의존하기 때문에, 복잡한 수지상 구조 및 응축된 수공체를 가진 뉴런은 이 분석에 적합한 과목이 아닙니다.
샘플 준비, 이미지 수집 및 후처리는 이 프로토콜의 중요한 단계입니다. 단일 LNvs의 고품질 원시 이미지는 수상 돌기 역학의 정확한 정량화에 필수적입니다. 우리의 데이터는 LNv 수상돌기 형태와 생리적 반응이 해부 30 분 이내에 신중하게 준비 된 애벌레 뇌 이식에서 잘 보존되어 있음을 나타냅니다. 관찰 가능한 뇌 조직 악화, 길쭉한 수.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다, 건강의 국립 연구소. 프로젝트 번호 1ZIANS003137.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Chameleon Vision II 다광자 레이저 | 코히런트 | ||
| 고진공 그리스 | 다우코닝 | 79751-30 | |
| LSM 780 이광자 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | Carl Zeiss | 직립 구성 | |
| 현미경 커버 유리 | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | : .csv 파일 처리를 위한 | Microsoft | |
| 드리프트 보정 및 디콘볼루션을 위한 | Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | |
| 3D 시각화 및 이미지 주석을 위한 | Imaris | Oxford Instruments | |
| < 강>시약 | |||
| 포도당 | |||
| HEPES, | |||
| KCl | |||
| , MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| TES |
참고문헌
- Wong, W. T., Wong, R. O. L. Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis. Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).
- Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. Dendritic D....
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재인쇄 및 허가
