Beş Omurgalı Grubu Arasında Merkezi Sinir Sistemi Mikrodamarlarının Güvenilir İzolasyon
Summary
Bu protokolün amacı lissencephalic ve gyrencephalic omurgalıların merkezi sinir sisteminin birden fazla bölgesinden mikrodamarları izole etmektir.
Abstract
Mikrodamarların merkezi sinir sisteminden (CNS) izolasyonu genellikle çoğu kemirgenler olmak üzere birden fazla hayvanDan kortikal doku birleştirilerek gerçekleştirilir. Bu yaklaşım korteksiçin kan-beyin bariyeri (BBB) özelliklerinin sorgulanmasını sınırlar ve bireysel karşılaştırmaya izin vermez. Bu proje birden fazla CNS bölgelerinden nörovasküler birim (NVU) karşılaştırma sağlayan bir izolasyon yönteminin geliştirilmesi üzerinde duruluyor: korteks, serebellum, optik lob, hipotalamus, hipofiz, beyin sapı, ve omurilik. Ayrıca, başlangıçta mürin örnekleri için geliştirilen bu protokol, mikro damarları beyin yarımkürebeyaz maddesinden izole edebildiğimiz küçük ve büyük omurgalı türlerinCNS dokularında kullanılmak üzere başarıyla uyarlanmıştır. Bu yöntem, immünetiketleme ile eşleştirilmiş, protein ekspresyonu ve bireyler arasında istatistiksel karşılaştırma, doku tipi veya tedavi nicelik sağlar. Bu uygulanabilirliği, nöroinflamatuar bir hastalık olan multipl sklerozun bir minür modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) sırasında protein ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirerek kanıtladık. Ayrıca, bu yöntemle izole mikrodamarlar qPCR, RNA-seq ve Batı lekegibi downstream uygulamaları için kullanılabilir, diğerleri arasında. Bu ultracentrifugation veya enzimatik dissociation kullanmadan CNS mikrodamarları izole etmek için ilk girişimi olmasa da, tek bireyler ve birden fazla CNS bölgelerinkarşılaştırma için onun ustalık benzersizdir. Bu nedenle, aksi takdirde belirsiz kalabilir farklılıkların bir dizi soruşturma için izin verir: CNS bölümleri (korteks, serebellum, optik lob, beyin sapı, hipotalamus, hipofiz, ve omurilik), CNS doku tipi (gri veya beyaz madde), bireyler, deneysel tedavi grupları ve türleri.
Introduction
Beynimiz vücudumuzdaki en önemli organdır. Bu nedenle, normalden sapmayı tetikleyebilecek dış etkenlere rağmen beyin homeostazı tutmak bir önceliktir. Bazı bilim adamlarına göre, yaklaşık 400-500 milyon yıl önce1, omurgalı hayvanlar şimdi kan-beyin bariyeri (BBB)2,3olarak bildiğimiz geliştirdi . Bu koruyucu “çit” sıkı iyonların taşınması düzenleyerek merkezi sinir sistemi (CNS) homeostazı ve fonksiyonları üzerinde en büyük etkiyi uygular, moleküller, ve kan ve CNS parankim arasında hücrelerin taşınması. BBB bozulduğunda, beyin toksik maruzkalma duyarlı hale gelir, enfeksiyon, ve inflamasyon. Bu nedenle, BBB disfonksiyonu ile ilişkili birçok, hepsi değilse, nörolojik ve nörogelişimsel bozukluklar4,5,6.
BBB sofistike fonksiyonu benzersiz CNS mikrovaskülküle nörovasküler birim (NVU) 2,3tarafından uygun atfedilir. Son derece özel endotel hücreleri, perisitler ve astrositik uç ayaklar NVU2,3hücresel bileşenleridir. Bu hücreler tarafından oluşturulan ekstrasellüler matriks de NVU ve BBB fizyolojisi için gereklidir2,3. NVU’nun temel hücresel ve moleküler bileşenleri omurgalılar arasında korunmuş olsa da, heterojenlik siparişler ve türler arasında rapor edilir7,8. Ancak, teknik sınırlamalar nörobiyoloji, biyomedikal veya çevirisel araştırmalardaki bu farklılıkları tam olarak göz önünde bulundurma yeteneğimizi engellemez.
Bu nedenle, beş omurgalı grubundan balık, amfibiler, sürüngenler, kuşlar ve memeliler gibi çok sayıda türe de uygulanabilmek için CNS bölgesine özgü mikrodamar izolasyon yöntemini genişlettik. Protokol, çevirisel alaka düzeyi9olan türler de dahil olmak üzere küçük lissensefalik ve büyük jinekolojik omurgalılarda kullanılmak üzere tanımlanmıştır. Ayrıca, bu bağlamda daha önce araştırılmayan, ancak nörofizyoloji ile ilgili ve muazzam klinik etkileri olan CNS’nin diğer bölgelerini de dahil ediyoruz: hipotalamus, hipofiz ve beyaz madde. Son olarak, nvu ve / veya BBB9,10,11 boyunca protein ekspresyonu değişiklikleri tanımlamak için güvenilir bir araç olarak bu izolasyon yöntemininkapasitesinitest etti. Kavram kanıtı olarak, EAE sırasında VCAM-1 ve JAM-B ekspresyonundaki değişikliklerin immünoresans tarafından izlenen izolasyon yöntemini kullanarak nasıl belirlenebileceğimizi gösterdik.
Protocol
Representative Results
Discussion
BBB sıkı sofistike bir mimari ile birleştiğinde beyin mikrovaskületür endotel hücrelerinin benzersiz özelliklerini içerir,, “peg-soket”- kavşaklar, ve yapışma plakları CNS homeostaz için kritik2,3,19. Endotel hücreleri özellikleri indüklenen ve perisitler ve çevreleyen astroglia son ayak süreçleri2tarafından korunur,3,19<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Cruz-Orengo California Üniversitesi, Davis, Veterinerlik Okulu Start Up Fonları tarafından desteklendi.
Materials
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
References
- Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
- Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
- Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
- Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).
- O’Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
- Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
- Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
- Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
- Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
- Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
- Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
- Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
- Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. 신경과학. 403, 4-16 (2019).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
- Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
- Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).
- Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
- Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048 (2017).
