Vi beskriver en protokol for celle-typespecifikke udtryk for den genetisk kodede FRET-baseret sensor ATeam 1.03Yemk i organotypiske skive kulturer af musen forhjernen. Desuden viser vi hvordan man bruger denne sensor til dynamisk billeddannelse af cellulære ATP-niveauer i neuroner og astrocytter.
Neuronal aktivitet i centralnervesystemet (CNS) fremkalder en stor efterspørgsel på cellulære energi, der leveres af nedbrydningen af adenosin trifosfat (ATP). En stor del af ATP er nødvendig for at re-installere ion gradienter på tværs af plasma membraner forringet af elektrisk signalering af neuroner. Der er tegn på, at astrocytter-selv om det ikke genererer hurtige elektriske signaler selv-undergår øget produktion af ATP som reaktion på neuronal aktivitet og støtte aktive neuroner ved at give energi metabolitter til dem. Den seneste udvikling af genetisk kodede sensorer til forskellige metabolitter gør det nu muligt at studere sådanne metaboliske interaktioner mellem neuroner og astrocytter. Her beskriver vi en protokol for celletype specifikt udtryk for ATP-følsom fluorescens resonans energioverførsel-(FRET-) sensor ATeam 1,03Yemk i organotypic vævs skive kulturer af musen hippocampus og cortex ved hjælp af adeno-associerede virale vektorer (AAV). Desuden viser vi, hvordan denne sensor kan anvendes til dynamisk måling af ændringer i cellulære ATP-niveauer i neuroner og astrocytter efter stigninger i ekstracellulært kalium og efter induktion af kemisk iskæmi (dvs. en hæmning af cellulære energimetabolisme).
Excitatoriske elektriske aktivitet af neuroner er i vid udstrækning baseret på flux af kationer såsom natrium (na+) og kalium (K+) på tværs af deres plasma membraner. Vedligeholdelse af de elektrokemiske gradienter af disse to ioner er således påkrævet for signalering. Dette opnås ved cellulær na+/k+-ATPase (nka), en allestedsnærværende udtrykt elektro gen transmembran pumpe, som ekstrudere 3 na+ ud af cellen i bytte for 2 K+ fra det ekstracellulære rum, der kræver forbrug af et molekyle af ATP pr. transport cyklus1. Ud over NKA er der flere andre ATP-forbrugende iontransportører, herunder plasma membranen ca2 +-ATPase, hvilket er afgørende for intracellulær ca2 + homøostase og dets eksport efter aktivitets induceret tilstrømning2. I præsynaptiske vesikler skaber en vacuolar-type H+-ATPase (v-ATPase) den protongradient, der er nødvendig for neurotransmitter optagelsen i dette rum3.
Mens aktiviteten af neuroner derfor kræver en betydelig mængde ATP4, de ikke udviser en betydelig kapacitet til oplagring af energi. I stedet, de synes at stole på metaboliske interaktioner med tilstødende astrocytter, de store glykogen butikker i hjernen5. Det er blevet antydet, at astrocytisk glykogen faktisk spiller en vigtig rolle i at støtte neuronal energibehov; og et centralt fænomen i denne foreslåede Neuro-metaboliske kobling mellem de to celletyper er astrocyternes kapacitet til at øge deres ATP-produktion som reaktion på neuronal aktivitet6,7,8. Denne hypotese, kendt som astrocyte-neuron laktat shuttle (anls), er stadig under debat, fordi andet arbejde har givet bevis for, at neuroner også kan øge deres egen sats af glycolyse som reaktion på stimulation9,10, afspejler nødvendigheden af yderligere metoder og tilgange til at studere Neuro-glia interaktion.
Undersøgelse af cellulære energimetabolisme og ATP niveauer i neuroner og astrocytter til at belyse Neuro-glia metaboliske interaktioner har længe været hæmmet af manglen på egnede sonder til påvisning af ændringer i metabolit koncentrationer i levende celler i hjernevæv. Det sidste årti har imidlertid givet en kraftig stigning i udviklingen af nye værktøjer og nye genetisk kodede fluorescerende sonder for forskellige metabolitter, herunder sensorer til ATP, lactat, pyruvat og andre11,12. Ved hjælp af disse værktøjer, er det nu muligt at direkte behandle spørgsmål relateret til cellulære ATP forbrug og ændringer i cellulære energi niveauer på enkelt celleniveau og i en celle-type specifik måde i intakt hjernevæv13.
I det nuværende arbejde, beskriver vi en procedure for at visualisere cytosolisk ATP dynamik på neuroner og astrocytter af dyrkede organotypiske hjernen skiver. Vi viser, hvordan man ansætter adeno-associerede virale vektorer (AAV) for celle-type specifikt udtryk for den genetisk kodede ATP-Nanosensor ATeam 1.03Yemk (14) i neuroner og astrocytter af skiver af muse hjernen, der kan opretholdes i cellekultur i flere uger15. En procedure for, hvordan man fjerner det gliale ar, der dækker dyrkede vævs skiver, er beskrevet, hvilket forbedrer optisk tilgængelighed og billeddannelse af celler i de organotypiske vævs lag nedenunder. Endelig viser vi, hvordan ATeam 1.03Yemk kan bruges til at udføre fret-baseret billeddannelse af ændringer i cellulære ATP-niveauer i denne forberedelse. Denne metode er vært for de store fordele, at det ikke kræver kirurgiske hjerne procedurer, giver høje niveauer af ekspression af sensoren og celletype specificitet i dyrkede hjerne skiver, reducere invasivitet eller stress i cellerne sammenlignet med andre metoder, ligesom transfektering ved elektro poration eller transduktion med andre virale vektorer10,16,17. Desuden kan denne protokol anvendes på andre FRET-baserede nanosensorer, blandt dem varianter af ATeam 1.03, der giver lavere bindingsaffinitet for ATP14.
Her demonstrerer vi en procedure for celle typen specifikt udtryk for ATeam 1.03Yemk, en fret-baseret, genetisk kodet Nanosensor14, til måling af ændringer i ATP-niveauer i astrocytter eller neuroner i organotypiske vævs skive kulturer i muse hjernen15. I eksemplariske optagelser viser vi, at en stigning i den ekstracellulære kaliumkoncentration ikke resulterer i en ændring i ATP-koncentrationerne i neuroner, mens astrocytiske ATP-niveauer stiger som reaktion på denne manipulation. Desuden, vores resultater viser, at ved hæmning af cellulære metabolisme, ATeam 1,03Yemk fret forholdet hurtigt falder i begge celletyper, indikerer en hurtig nedgang i intracellulære ATP.
Udtryk for ATeam 1,03Yemk i organisk skive kulturer kræver vedligeholdelse af vævet i kulturen under kontrollerede forhold i mindst 7-10 dage. Alternativt kan ateam 1.03yemk også anvendes til måling af ATP i akut isolerede hjernevæv skiver og i optiske nerver af mus13,15. Målinger i akut isoleret væv, dog nødvendiggør generering af transgene dyr eller en Stereotaktisk anvendelse af virale vektorer i hjernen, der involverer dyreforsøg og strenge dyrepleje protokoller. I denne henseende er ateam 1,03yemk udtryk i organiske typiske vævs skive kulturer et nyttigt og værdifuldt alternativ22,23. I mange år nu, organotypic vævs skive kulturer tjene som en etableret model system til at studere neurale egenskaber, konnektivitet og udvikling24,25,26. De bevarer ikke kun den generelle vævs arkitektur og laminering (figur 1), men er også vært for de præference egenskaber af cellekulturer såsom overlegen tilgængelighed og direkte kontrol af eksperimentelle forhold. Organotypic vævs skive kulturer er også rutinemæssigt ansat til at udtrykke fremmede gener ved hjælp af virale vektorer27. Flere typer af virale vektorer er blevet rapporteret til at levere transgener i hjernevæv16,28. Adenoviral vektorer inducerer høj ekspression i gliaceller celler, men ikke hippocampus neuroner16, og kan generere gliaceller reaktivitet17. Adeno-associerede virale vektorer som anvendes her fremstå som et godt alternativ15, og deres effektivitet er også blevet vist i vivo29.
Mens der hovedsagelig anvendes til undersøgelse af neuronal egenskaber, nylige undersøgelser har fastslået, at organotypic vævs skive kulturer kan også anvendes til analyse af astrocytter. Kultiverede skiver er normalt dækket af et lag af reaktive astrocytter19,30 (figur 5), men astrocytter udviser en mere indfødt, ikke-reaktiv morfologi og cytoarkitektur i dybere lag19,30 (figur 5). I nærværende undersøgelse beskriver vi en procedure for mekanisk fjernelse af det ydre gliaceller ar, hvilket resulterer i en bedre eksperimentel og optisk tilgængelighed af indfødte astrocytter inden for de rette organotypiske vævs lag. Desuden, dens fjernelse forbedrer ekspression effekt i dybere lag af organotypiske skiver; Hvis det gliale ar ikke fjernes, kan transduktion af AAVs have tendens til at være begrænset til de overfladiske cellelag.
Flere eksterne mekaniske faktorer skal tages i betragtning, når der udføres eksperimenter i vævs skiver. En variation i badet perfusion hastighed kan inducere bevægelser af hele præparatet og/eller inducere ændringer i fokus, hvilket resulterer i kunstige forbigående ændringer af sensorsignalet. Desuden, både astrocytter og neuroner er blevet rapporteret til at reagere på mekanisk deformation såsom pålagt af høje perfusion satser32,33. I vores hænder, ved hjælp af en pålidelig peristaltisk pumpe, sammen med at opretholde små og stabile mængder af saltvand mellem vævet og målet (meniscus) resulterer i en stabil FRET-signal under baseline betingelser ved perfusion hastighed anvendes her (1,5-2,5 mL/min; Figur 8).
I denne undersøgelse viser vi også, at FRET-baseret billeddannelse med ATeam 1.03Yemk kan anvendes til at overvåge ATP-niveauer i neuroner og astrocytter. Et alternativt middel introduceret tidligere til måling af cellulære ATP er den såkaldte luciferin-luciferase assay34,35,36,37. Denne fremgangsmåde er imidlertid baseret på billeddannelse af bioluminescens og giver kun en forholdsvis lav tidsmæssig og rumlig opløsning til dels på grund af høje baggrundsstøj niveauer. En anden metode rutinemæssigt anvendt i de seneste år var billeddannelse af ændringer i den intracellulære magnesium koncentration ved hjælp af ion-følsomme fluoroforet magnesium grøn38,39,40. Denne fremgangsmåde vedrører den konstatering, at et forbrug af ATP resulterer i frigivelsen af dets co-faktor magnesium. Billeddannelse med magnesium grøn giver således kun et sekundært skøn over ændringer i ATP-niveauerne. Desuden er magnesium Green også følsom over for ændringer i intracellulær calcium, hvilket introducerer en anden vanskelighed ved tolkning af resultater opnået med denne metode.
Den seneste udvikling af genetisk kodede nanosensorer til direkte billeddannelse af cellulære metabolitter, derfor repræsenterede et stort skridt fremad11,12. Flere forskellige sensorer blev genereret, der kan anvendes til måling af intracellulære ATP36,41,42,43. Blandt disse er den ratiometriske-fluorescerende ATP-indikator “QUEEN”41 samt PercevalHR, som sanser ATP: ADP ratio42. Mens sidstnævnte sonde er et værdifuldt værktøj til undersøgelse af cellernes energi status, kræver det samtidig måling af ændringer i pH42.
ATeam er en Nanosensor, som der findes flere varianter af, som — blandt andre — adskiller sig fra hinanden i deres bindingsaffinitet for ATP14. In vitro udviser ATeam 1,03yemk en Kd på 1,2 mm ved 37 °c, hvilket er tæt på cellulære ATP-niveauer bestemt i forskellige neuronal celletyper, der spænder fra hypothalamus og cerebellum34 til hippocampus37,44,45. Ved kuvette målinger resulterede sænkning af temperaturen med 10 °C i et signifikant fald i ATeam 1.03Yemens bindingsaffinitet til ATP, hvilket tyder på, at det måske ikke er ideelt til cellulær billeddannelse ved stuetemperatur14. Vores tidligere undersøgelse15, dog, viste, at adfærd og respons af ateam 1,03yemk udtrykt i neuroner og astrocytter til forskellige manipulationer er ens på nær fysiologiske og ved stuetemperatur, hvilket indikerer, at sensoren giver pålidelig bestemmelse af intracellulære ATP niveauer under begge betingelser. Derudover behandlede vores tidligere eksperimenter pH-følsomheden af ATeam 1,03Yemk udtrykt i cellerne15, hvilket viser, at det er ufølsomt over for ændringer i intracellulær pH med ca. 0,1-0,2 pH-enheder. Hvis Kd i den lave mm rækkevidde er en bekymring, alternative ateam varianter kan anvendes14, blandt dem rød-skiftede varianter af ATEAM (“Go-ateam”)43.
Vores eksperimenter med ATeam 1,03yemk viser, at en stigning i den ekstracellulære kaliumkoncentration med nogle få mm kun (fra 3 til 8 mm) resulterer i en forbigående stigning i Ateam 1,03yemk ratio i astrocytter i organotypiske skive kultur. Denne observation bekræfter tidligere undersøgelser15,46 og tydeligt indikerer, at astrocytter reagerer på frigivelsen af kalium af aktive neuroner med en stigning i deres ATP-produktion, for det meste sandsynligvis som følge af en stimulering af na+/k+-ATPase ogna +/HCO3– cotrans Porter, henholdsvis47,48. I modsætning til dette viste neuroner ikke et svar, hvilket er i tråd med tidligere arbejde samt15. Begge celletyper reagerede dog hurtigt og stærkt på hæmning af cellulær glycolyse og mitokondrie respiration som vist før15. Under betingelser af kemisk iskæmi, ATeam FRET nøgletal faldt til et nyt stabilt niveau, hvilket indikerer en nominel udtømning af cellulære ATP. Sidstnævnte resultat tyder på, at både neuroner samt astrocytter udviser et relevant forbrug af ATP også under Steady-State betingelser uden yderligere stimulation ved synaptisk aktivering eller anvendelse af neurotransmittere. Tilsammen konkluderer vi, at FRET-baseret billeddannelse med genetisk kodede nanosensorer, blandt dem ATeam 1,03Yemk, vil give en værdifuld tilgang til at belyse de cellulære processer, der er ansvarlige for ændringer i intracellulære ATP-niveauer og cellulære ATP-forbrug under forskellige forhold.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Claudia Roderigo og Simone Durry for teknisk ekspertbistand. Vi takker Dr. Niklas J. Gerkau og M.Sc. Joel Nelson for hjælp til forberedelsen af de organotypiske skive kulturer. Forskningen i forfatterens laboratorium blev finansieret af den tyske forsknings sammenslutning (DFG; FOR 2795: ro 2327/13-1 og SPP 1757: ro 2327/8-2 til CRR; og SPP 1757: unge glia-opstarts midler til RL).
2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
Microscope stage | custom build | ||
Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |