人类干细胞衍生内皮细胞和GABAergic神经元的迁移、化学吸引和共培养测定
Summary
我们提出了三个简单的体外测定-远距离迁移测定，共培养迁移测定，和化学吸引力测定-共同评估人类干细胞衍生的腹膜内皮细胞的功能及其与GABAergic内神经的相互作用。
Abstract
脑血管在神经系统发育和脑病病因中的作用日益受到重视。我们最近的研究已经确定了一种特殊的血管细胞群体，即腹膜内皮细胞，在胚胎发育期间前脑GABAergic内神经元的迁移和分布中起着关键作用。这，加上他们的细胞自主功能，暗示了前心室内皮细胞在神经精神病（如精神分裂症、癫痫和自闭症）的病理学中的新作用。在这里，我们描述了三种不同的体外测定，它们共同评估腹膜内皮细胞的功能及其与GABAergic内神经元的相互作用。使用这些检测方法，特别是在人类环境中，将使我们能够识别腹膜内皮细胞和大脑疾病之间的联系。这些测定简单、成本低、可重复，可轻松适应任何粘附细胞类型。
Introduction
内皮细胞形成血管的衬里，调节重要功能，包括维持血管壁渗透性、调节血流、血小板聚集和形成新血管。在大脑中，内皮细胞构成一个关键的血液-脑屏障的一部分，它严格控制大脑和血液之间的物质交换。我们在过去十年的研究已经确定了大脑内皮细胞的神经原发生新作用，这些作用对大脑发育和行为2、3、4、5有重要影响。我们已经表明，小鼠胚胎前脑是由两个不同的子类型的血管，皮面和腹周血管，在解剖学，起源和发育轮廓2不同。内皮细胞衬里这两个血管亚型显示其基因表达配置文件明显的差异。虽然皮叶细胞大多表达与炎症和免疫反应相关的基因，但腹腔内皮细胞在表达通常与神经发生、神经元迁移、化学和轴神指导3相关的基因时，具有独特的丰富性。外皮内皮细胞也拥有一种新的GABA信号通路，不同于传统的神经元GABA信号通路5。与其基因表达相伴，发现外膜内皮细胞调节发育中新皮质中GABAergic内神经元的迁移和分布。在胚胎发育过程中，腹腔内皮细胞沿腹膜-背梯度进行远距离迁移，以建立腹腔血管网络2、3。一天后，内神经内向反映了这种迁徙路线。迁移的内神经元与预先形成的外皮血管网络进行物理交互，并用作在新皮质到达最终目的地的指南。除了作为物理基质外，腹膜内皮细胞还充当迁移神经元的导航线索来源。前心内皮细胞分泌GABA指导内神经元迁移并调节其最终分布模式4。内神经元迁移和分布的缺陷与神经精神病有关，如自闭症、癫痫、精神分裂症和抑郁症6，7，8，9，10。因此，研究前心室内皮细胞功能及其对人类环境中的内神经元迁移的影响，对于解决这些疾病的发病机制至关重要。
我们利用诱导多能干细胞（iPSC）技术12、13，从人类胚胎干细胞中生成了人类造血干细胞。为了验证人类腹膜内皮细胞是否忠实地模仿小鼠腹膜内皮细胞，并定量评估它们对内神经元迁移的影响，我们开发了三种体外测定：远距离迁移测定、共培养迁移测定和化学吸引力测定。在这里，我们详细描述了这些检测的协议。所有三种检测都基于硅培养插件的使用，以创建一个小矩形的细胞补丁（固定尺寸），周围环绕着无细胞空间。迁移距离是通过测量单元格的最终位置与第 0 天已勾勒的矩形贴片边框之间的距离来评估的。在远距离迁移测定中，人类腹膜内皮细胞在35毫米盘的中心作为斑块播种，并计算细胞在长时间内所经过的距离。在共培养迁移测定中，人类腹膜内皮细胞与人类内膜细胞共同播种，作为35毫米盘中的一个斑块。此设置允许检查这两种细胞类型的直接物理相互作用对内神经元迁移速率的影响。化学吸引力测定测量内神经元的迁移，以响应人类腹膜内皮细胞分泌的化学吸引力线索。内侧神经元被播种为矩形斑块，与人腹膜内皮细胞和控制非外膜内皮细胞播种作为类似大小的补丁在两侧。每个细胞斑块都通过500μm的无细胞间隙分离。 与对照非外皮内皮细胞相比，通过量化向外皮内皮细胞迁移的细胞数量来评估内神经元的反应。
这些测定提供了对人腹膜内皮细胞功能及其对内神经元迁移的影响的有力评估。长距离测定和共培养迁移测定的新颖设置提供了厘米（±1-1.5 cm）范围内的无细胞空间，允许远距离迁移检测。表1概述了我们与其他常用检测相比的检测特征。总体而言，这里描述的测定将作为一个平台，用于评估”患病”的外室内皮细胞和由精神分裂症、自闭症或癫痫等脑疾病的iPSC产生的内神经元。这些测定也可用于确定不同条件（如抑制剂、配体、RNAi）如何影响细胞迁移。最后，这些测定可以针对其他细胞类型进行优化，以测量远距离迁移、化学吸引或细胞介导迁移。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了三个体外测定，一起提供定量评估的人类腹膜内皮细胞特异性特性。这些测定对于获得人类外皮内皮细胞与人类内皮细胞相互作用的机械性见解将非常有价值。使用配体、抑制剂或具有基因特异性敲除或过度表达的细胞的实验将识别或验证介导内皮细胞引导的内神经元迁移或腹膜内皮细胞远距离迁移特性的分子。这些测定还可以修改以执行活细胞延时迁移研究。此外，还有证?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家精神卫生研究所（R01MH110438）和国家神经疾病和中风研究所（R01NS100808）颁发的AV奖的支持。
Materials
| Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
| Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
| Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
| Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
| Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
| Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
| Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
| DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
| Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
| Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
| Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
| Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
| poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
| PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
| 2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
| 3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
| 35 mm dish | Corning | 430165 | |
| 15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
| Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |
References
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