Migración, Chemo-Atracción, y Co-Cultura Ensayos para Células Endoteliales Derivadas de Células Madre Humanas y Neuronas GABAérgicas

Summary

Presentamos tres ensayos simples in vitro: el ensayo de migración de larga distancia, el ensayo de migración de cocultura y el ensayo de quimio-atracción, que evalúan colectivamente las funciones de las células endoteliales periventriculares derivadas de células madre humanas y sus interacción con las interneuronas GABAérgicas.

Abstract

Papel de la vasculatura cerebral en el desarrollo del sistema nervioso y etiología de los trastornos cerebrales está ganando cada vez más atención. Nuestros estudios recientes han identificado una población especial de células vasculares, las células endoteliales periventriculares, que desempeñan un papel crítico en la migración y distribución de las interneuronas GABAérgicas prefálico durante el desarrollo embrionario. Esto, junto con sus funciones celulares-autónomas, alude a nuevos roles de células endoteliales periventriculares en la patología de trastornos neuropsiquiátricos como la esquizofrenia, la epilepsia y el autismo. Aquí, hemos descrito tres diferentes ensayos in vitro que evalúan colectivamente las funciones de las células endoteliales periventriculares y su interacción con las interneuronas GABAérgicas. El uso de estos ensayos, particularmente en un contexto humano, nos permitirá identificar el vínculo entre las células endoteliales periventriculares y los trastornos cerebrales. Estos ensayos son simples, de bajo costo y reproducibles, y se pueden adaptar fácilmente a cualquier tipo de célula adherente.

Introduction

Las células endoteliales forman el revestimiento de los vasos sanguíneos y median funciones importantes que incluyen el mantenimiento de la permeabilidad de la pared de los vasos sanguíneos, la regulación del flujo sanguíneo, la agregación plaquetaria y la formación de nuevos vasos sanguíneos. En el cerebro, las células endoteliales forman parte de una barrera hematoencefálica crítica que controla estrechamente el intercambio de materiales entre el cerebro y el torrente sanguíneo¹. Nuestros estudios en la última década han identificado nuevos roles neurogénicos de las células endoteliales cerebrales que tienen implicaciones significativas para el desarrollo y el comportamiento cerebral^2,3,4,5. Hemos demostrado que el cerebro embrionario del ratón está vascularizado por dos subtipos distintos de vasos, los vasos piales y los vasos periventriculares, que difieren en anatomía, origen y perfil de desarrollo^2. Las células endoteliales que recubren estos dos subtipos de recipientes muestran diferencias claras en sus perfiles de expresión génica. Mientras que las células endoteliales piales en su mayoría expresan genes relacionados con la inflamación y la respuesta inmune, las células endoteliales periventriculares se enriquecen de forma única en la expresión de genes comúnmente asociados con neurogénesis, migración neuronal, quimiotaxis y orientación de axón³. Células endoteliales periventriculares también albergan una novedosa vía de señalización GABA que es distinta de la vía de señalización GABA neuronal tradicional⁵. Concomitante con su expresión génica, se encontraron células endoteliales periventriculares para regular la migración y distribución de las interneuronas GABAérgicas en el neocórtex en desarrollo. Durante el desarrollo embrionario, las células endoteliales periventriculares se someten a migración a larga distancia a lo largo de un gradiente ventral-dorsal para establecer la red vascular periventricular^2,3. Esta ruta migratoria es reflejada un día después por las interneuronas. Las interneuronas migratorias interactúan físicamente con la red vascular periventricular preformada y la utilizan como guía para llegar a su destino final en el neocórtex. Además de actuar como un sustrato físico, las células endoteliales periventriculares sirven como la fuente de señales de navegación para las neuronas migratorias. GABA secreto celular endotelial periventricular guía la migración interneurony regula sus patrones de distribución final^4. Los defectos en la migración y distribución interneurona se asocian con trastornos neuropsiquiátricos como autismo, epilepsia, esquizofrenia y depresión^6,7,8,9,10. Por lo tanto, el estudio de las funciones de las células endoteliales periventriculares y su influencia en la migración interneuronal en el contexto humano se vuelve fundamental para abordar la patogénesis de estos trastornos.

Hemos generado células endoteliales periventriculares humanas a partir de células madre embrionarias humanas en nuestro laboratorio^11,utilizando la tecnología inducida de células madre pluripotentes (iPSC)^12,13. Para validar si las células endoteliales periventriculares humanas imitan fielmente las células endoteliales periventriculares del ratón, y para evaluar cuantitativamente su influencia en la migración interneuronica, desarrollamos tres ensayos in vitro: un ensayo de migración a larga distancia, un ensayo de migración de cocultivo y un ensayo de quimio-atracción. Aquí describimos los protocolos para estos ensayos en detalle. Los tres ensayos se basan en el uso de inserciones de cultivo de silicona para crear un pequeño parche rectangular de celdas (de dimensiones fijas) rodeados de espacio libre de celdas. La distancia de migración se evalúa midiendo la distancia entre las posiciones finales de las celdas desde el borde del parche rectangular que se ha descrito el día 0. En el ensayo de migración de larga distancia, las células endoteliales periventriculares humanas se sembran como un parche en el centro de un plato de 35 mm, y se calculan las distancias recorridas por las células durante un largo rango de tiempo. En el ensayo de migración de cocultivo, las células endoteliales periventriculares humanas se co-sembran con interneuronas humanas como un parche en un plato de 35 mm. Esta configuración permite examinar el efecto de las interacciones físicas directas de estos dos tipos de células en la tasa de migración de las interneuronas. El ensayo de quimio-atracción mide la migración de las interneuronas en respuesta a las señales quimio-atractivas secretadas por las células endoteliales periventriculares humanas. Las interneuronas se sembran como un parche rectangular, con células endoteliales periventriculares humanas y controlar las células endoteliales no periventriculares sembradas como parches de tamaño similar a ambos lados. Cada uno de los parches celulares están separados por una brecha libre de células de 500 m. La respuesta de las interneuronas se evalúa cuantificando el número de células que han migrado hacia las células endoteliales periventriculares en comparación con el control de las células endoteliales no periventriculares.

Estos ensayos proporcionan una evaluación sólida de las funciones de las células endoteliales periventriculares humanas y su influencia en la migración interneuronal. La novedosa configuración del ensayo de larga distancia y el ensayo de migración de cocultura proporciona espacio libre de células en el rango de centímetros (1-1,5 cm) para permitir la detección de la migración de larga distancia. En la Tabla 1se presenta un resumen de las características de nuestros ensayos en comparación con otros ensayos populares. Colectivamente, los ensayos descritos aquí servirán como plataforma para evaluar las células endoteliales periventriculares “enfermas” y las interneuronas generadas a partir de iPSC s de trastornos cerebrales como la esquizofrenia, el autismo o la epilepsia. Estos ensayos también se pueden utilizar para determinar cómo diferentes condiciones (por ejemplo, inhibidores, ligandos, ARN) afectan la migración celular. Por último, estos ensayos se pueden optimizar para otros tipos de células para medir la migración a larga distancia, la quimioatracción o la migración mediada por células celulares.

Protocol

1. Cultivo y almacenamiento de células endoteliales periventriculares humanas Mantener las células endoteliales periventriculares humanas en la matriz de membrana del sótano recubiertas (ver Tabla de Materiales) placas de 6 pocillos en medio de células endoteliales periventriculares (medio E6 que contiene 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/ml FGF2 y 5 oM GABA) a 37 oC y 5% deCO2. Cambie el medio cada día alterno. Descongelar la matriz de membrana del sótano en 4oC y hacer una so…

Representative Results

Los pasos para configurar una plaquita de cultivo de un solo pozo dentro de un plato de 35 mm se muestran en la Figura 1. El ensayo de migración de larga distancia y el ensayo de migración de cocultivo utilizaron un inserto de un solo pozo para sembrar el número deseado de células en el centro de un plato de 35 mm recubierto de poli-L-ornitina/laminina. En el día 0, las celdas estaban presentes como un parche rectangular(Figura 2</st…

Discussion

Aquí, describimos tres ensayos in vitro que juntos proporcionan una evaluación cuantitativa de las propiedades específicas de las células endoteliales periventriculares humanas. Estos ensayos serán valiosos para obtener información mecanicista sobre la interacción de las células endoteliales periventriculares humanas con las interneuronas humanas. Los experimentos con ligandos, inhibidores o células con derribo o sobreexpresión específicos de genes identificarán o validarán jugadores moleculares que median l…

Materials

Accutase dissociation solution	Millipore Sigma	SCR005	Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody	Biolegend	802001
Anti-human CD31 antibody	Millipore Sigma	CBL468
Anti- MAP2 antibody	Neuromics	CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody	Millipore Sigma	AB3623
Control human endothelial cells	Cellular Dynamics	R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement	Cellular Dynamics	M1019
Cryogenic vials	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 medium	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 medium	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronectin	Thermofisher Scientific	33016-015
Freezing Container	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Human GABAergic neurons	Cellular Dynamics	R1013
Human GABAergic neurons base medium	Cellular Dynamics	M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement	Cellular Dynamics	M1032
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
Mounting Medium	Vector laboratories	H-1200
poly-L-ornithin	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypan blue	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientific	12563011	Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert	ibidi	80209
3-well silicone culture-Insert	ibidi	80369
35 mm dish	Corning	430165
15-ml conical tube	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA solution	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	14-832-11
Inverted phase contrast microscope	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope	Olympus	FSX-100