Detta protokoll beskriver en metod för att spåra enskilda hjärnan-åldrande banor genom en hjärna donation program och korrekt karakterisering av hjärnor. Brain givare är involverade i en långsiktig longitudinell studie inklusive seriella flerdimensionella bedömningar. Protokollet innehåller en detaljerad beskrivning av hjärnans bearbetning och en korrekt diagnostisk metodik.
I en ständigt åldrande befolkning förväntas prevalensen av neurodegenerativa störningar stiga. Att förstå sjukdomsmekanismer är nyckeln för att hitta förebyggande och botande åtgärder. Det mest effektiva sättet att uppnå detta är genom direkt undersökning av sjuka och frisk hjärnvävnad. Författarna presenterar ett protokoll för att erhålla, bearbeta, karakterisera och lagra god kvalitet hjärnvävnad som donerats av individer som registrerats i en antemortem hjärnan donation program. Donationen programmet innehåller en ansikte mot ansikte empatisk inställning till människor, en samling av kompletterande kliniska, biologiska, sociala och livsstil information och seriella flerdimensionella bedömningar över tiden för att spåra enskilda banor av normalt åldrande och kognitiv försämring. Eftersom många neurologiska sjukdomar är asymmetriska, erbjuder vår hjärnbank ett unikt protokoll för skivning av färska exemplar. Hjärnsektioner av båda halvkloten är omväxlande frysta (vid -80 °C) eller fixerade i formalin; ett fast segment på en halvsfär motsvarar en fryst på den andra hjärnhalvan. Med detta tillvägagångssätt kan en komplett histologisk karakterisering av allt fryst material erhållas, och omics studier kan utföras på histologiskt väldefinierade vävnader från båda halvkloten därmed erbjuda en mer komplett bedömning av neurodegenerativa sjukdomsmekanismer. Korrekt och bestämd diagnos av dessa sjukdomar kan endast uppnås genom att kombinera det kliniska syndromet med den neuropatologiska utvärderingen, som ofta lägger till viktiga etiologiska ledtrådar som krävs för att tolka patogenesen. Denna metod kan vara tidskrävande, dyr och begränsad eftersom den endast omfattar ett begränsat geografiskt område. Oavsett dess begränsningar, kan den höga graden av karakterisering det ger vara givande. Vårt slutmål är att etablera den första italienska hjärnbanken, samtidigt som vi betonar vikten av neuropatologiskt verifierade epidemiologiska studier.
Enligt WHO lider för närvarande cirka 50 miljoner människor av demens, en siffra som beräknas tredubblas fram till 2050. Alzheimers sjukdom är den främsta orsaken till demens, följt av cerebrovaskulär sjukdom och andra åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar. År 2017 utvecklade WHO Det globala demensobservatoriet för att öka medvetenheten om demens och uppmuntra en global handlingsplan mot den1. Varje individ har sin egen hjärna åldrande bana, därför sökandet efter botemedlet kan vara utmanande på grund av komplexiteten i patogenesen vid neurodegenerativa sjukdomar. Kanske har varje person henne eller sin egen patogenes skriven i hjärnvävnaden kräver en personlig strategi. Således kommer studiet av hjärnvävnad vara nyckeln till att förstå mekanismerna för neurodegeneration.
Om vi ser tillbaka på neurovetenskapens historia inser vi att de mest imponerande och banbrytande upptäckterna aldrig skulle ha kunnat inträffa utan direkt undersökning av den mänskliga hjärnan. Under tiden har källan till hjärnvävnad som ska studeras förändrats från råa dissektioner, slumpmässiga “chansmöten” och, i vissa fall, olaglig handel, till organiserade hjärnsamlingar och strategiska moderna hjärnbanker. Övervägandet av många etiska aspekter är en av de viktigaste faktorerna som skiljer moderna hjärnbanker från hjärnans samlingar från det förflutna. Den första riktiga moderna Brain Banks (BBs) instiftade under andra hälften av20-talet. Nicholas Corsellis och Wallace Tourtelotte kan anses vara pionjärer inom modern hjärnbank. I Storbritannien, Corsellis samlat en samling som håller över 1000 väldokumenterade hjärnor påverkas med olika psykiska och neurologiska sjukdomar2. Dessutom hjälpte Corsellis avslöja behovet av att bevara färsk hjärnvävnad i is för den skull biokemiska tester3. Under tiden i USA, Wallace Tourtelotte infört antemortem hjärnan donation program för att underlätta värvning av potentiella hjärnan givare och se till att de insamlade hjärnorna åtföljs av en komplett medicinsk och neurologisk historia4,5. För en historisk översikt över hjärnsamlingar och moderna BBs, se Carlos et al. 6.
Så, varför behöver vi fortfarande mänskliga hjärnor? Hjärnsjukdomar kan endast ges en bestämd diagnos efter neuropatologisk undersökning. Neuropatologin utmanar den kliniska diagnosen, och är nyckeln till en korrekt tolkning av de kliniska symptomen och till upptäckten av de histologiska grunderna för nya syndromatiska varianter. I själva verket kan diagnosen omdefinieras baserat på den patologiska bilden. Icke desto mindre har obduktionsfrekvensen minskat under de senaste decennierna på grund av den senaste utvecklingen av innovativa neuroimaging tekniker. Genom hjärnavbildning kan de morfologiska, funktionella och metaboliska förändringarna i hjärnan, liksom omfattningen av protein felveckning, bedömas in vivo. Emellertid, in vivo neuroimaging och andra biomarkör studier kan bara ge en “uppskattning” av den patologiska bilden eftersom de inte kan upptäcka subtila cellulära och molekylära förändringar. Framsteg inom molekylär avbildning och upptäckten av nya biomarkörer, målmolekyler och spårämnen7 (t.ex. amyloid, TAU, mikroglial spårämnen) gör den mänskliga hjärnan ännu mer oumbärlig för tolkningen av data som erhållits från kliniska utvärderingar och biomarkörtestning. Vidare, omikteknikerna (genomik, epigenomik, transkriptomik, metabolomik, proteomik, lipidomik, etc.), utförs på färsk och frusen hjärnvävnad, öppnade nya möjligheter för att förstå sjukdomar mekanismer och upptäcka riskgener, nya diagnostiska och prognostiska markörer, och potentiella läkemedel mål8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
För dessa ändamål, moderna BBs arkiv väl karakteriserade, högkvalitativa hjärnvävnader gör dem tillgängliga för det vetenskapliga samfundet3,24. Hjärnorna som levereras av BBs bör åtföljas av en fullständig klinisk historia. Verksamheten i en BB omfattar följande: (1) Erkännande och rekrytering av sjuka och friska individer till hjärnan donation program; det ideala villkoret skulle vara att uppnå en tvärvetenskaplig uppföljning av donatorer under hela livet för att få en komplett klinisk, livsstil och social historia, och biomarkörprofiler; verkligen, kognitiv reserv och hjärnans struktur beror på livsstil och socio-pedagogiskafaktorer 25,26, så dessa uppgifter berikar den totala data till hands. (2) Förvärv av hjärnan (bestående av storhjärna, lillhjärnan och hjärnstammen) och relaterade vävnader (t.ex., ryggmärg, kranialnerv och ganglier, etc.) efter givarens frånfälle, hela tiden observera standardiserade rättsliga och etiska föreskrifter. (3) Lämplig bearbetning (dissektion, fixering, frysning) av hjärnan, enligt definitionen i ett standardiserat operativt protokoll, för att erhålla vävnad av hög kvalitet och för att möjliggöra framtida användning i tvärvetenskaplig forskning. (4) Detaljerad neuropatologisk karakterisering som ger en slutlig bestämd diagnos. (5) Lagring och distribution av vävnadsmaterial till forskarsamhället27,28.
Alla BBs lagra både frysta och formalin-fast-paraffin inbäddade vävnader. Varje BB har sitt eget protokoll. Med undantag för särskilda studier, såsom bihemispheric skär protokoll av Biomedical Research Institute (New Jersey)29 och Deramecourt studie av cerebrovaskulär patologi30, den största BBs i världen helt enkelt skära storhjärnan, cerebellum och hjärnstammen längs mittlinjen (sagittal plan). Ena halvan dissekeras färska och sedan frysta för biokemiska studier, medan den andra är fast i formalin för histopatologisk bedömning. Så, biokemiska och histopatologiska analyser utförs separat på varje halvklot. Beslutet om vilken sida som är fast eller fryst (lateralitet), beror påsingularbanken 31,32,33,34,35. Eftersom många neurologiska sjukdomar är asymmetriska erbjuder vår BB ett unikt protokoll för skivning av färska hjärnor: intilliggande sektioner av hjärnstammen och varje halvklot är växelvis fasta och frysta; ett fast segment på en halvsfär motsvarar en fryst på den andra hjärnhalvan. Genom denna metod optimeras användningen av hjärnvävnad, och en fullständig histologisk karakterisering av allt fruset material kan uppnås med möjlighet att erhålla och jämföra histologisk och biokemisk information från alla områden av båda halvkloten.
Ramen för vårt hjärnbanksprojekt är staden Abbiategrasso. Abbiategrasso är en liten stad cirka 22 km sydväst om staden Milano, i norra Italien. Den har en befolkning på cirka 32.600 personer. Det är hem till Golgi-Cenci (GC) Foundation. GC Foundation är en del av ett stort Rehabilitation Geriatric Hospital (ASP Golgi-Redaelli), och är ett institut med fokus på forskning om åldrande och äldreomsorg. Särskilt fokuserar den på att studera mentalt åldrande, de sociala och beteendemässiga faktorer som påverkar det, och biologi och patologi underliggande åldersberoende neurokognitiva störningar (NCDs). 2009 lanserade GC Foundation en ny longitudinell studie med 1321 deltagare (av 1644 berättigade försökspersoner: den initiala svarsfrekvensen på 80,3 %) född mellan 1935 och 1939 (i åldrarna mellan 70–75 år), av kaukasisk etnicitet, bosatt i samma lilla geografiska område. Studien kallades InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; på engelska: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) och pågår för närvarande. InveCe.Ab planeras att erhålla en kohort med maximal homogenitet och minst variabilitet för att bedöma demensens incidens, prevalens och naturhistoria, tillsammans med dess möjliga risk- eller skyddsfaktorer, inklusive beteendemässiga, psykosociala, kliniska och biologiska variabler36. Kohortens egenskaper visas i figur 1 och tabell 1. De epidemiologiska uppgifterna överensstämmer med demenstrenden i deneuropeiska populationen 37,38 och InveCe.Ab-deltagarna har homogena genetiska och miljömässiga egenskaper, vilket representerar en bra modell för att studera banan från normalt åldrande till neurokognitiva sjukdomar. Faktum är att homogena populationer kräver färre försökspersoner för att nå tillräcklig statistisk makt. InveCe.Ab-metodiken har redan rapporteratspå andra ställen 36 men det är viktigt att understryka dess flerdimensionella tillvägagångssätt genom periodiska kontroller (var 2–3 år) med hjälp av samma uppsättning utvärderingar inklusive: blodprovstagning (metabolisk panel, homocystein och vitaminer, DNA-extraktion för att profilera Apolipoprotein E (APOE) och andra genetiska polymorfiser relaterade till kognition och åldrande), antropometriska mätningar (vikt, längd och midja), Talking While Walking Test (dual task test), en intervju för att bedöma livsstil (Medelhavskostens följsamhet, nivåer av fysisk aktivitet och kognitivt engagemang) och sociala faktorer (socialt engagemang, ensamhet), en neuropsykologisk utvärdering och en klinisk allmän undersökning. Att jämföra sådana longitudinella data med postmortem neuropatologiska data skulle vara avgörande för forskning. Därför vårt team och särskilt Dr Michela Mangieri tänkt neuropatologiska metoden som nämns ovan. Sedan 2014 och under den andra uppföljningen ombads InveCe.Ab-deltagarna att donera sina hjärnor, och därmed åstadkomma abbiategrasso-hjärnbankens (ABB) födelse . De centrala givarna av ABB är InveCe.Ab deltagarna men ABB är nu öppen för andra frivilliga givare. De är patienter från ASP Golgi-Redaelli, hem till flera patienter som drabbats av olika neurologiska sjukdomar eller vuxna frivilliga som lär sig om ABB-projektet och tillhör samma geografiska område (Abbiategrasso och omgivning). Alla givare genomgår samma utvärderingsprotokoll.
Författarna föreslår en metod för att spåra enskilda banor för normalt åldrande och den möjliga utvecklingen till NCDs, och att exakt hantera, bearbeta och karakterisera hjärnor som förvärvats från sådana givare följt longitudinellt. Vårt mål är dessutom att möta och engagera individer i periodiska neurologiska bedömningar, seminarier och pedagogiska aktiviteter gällande hjärnans välbefinnande och att öka deras medvetenhet om hjärndonation för forskningsändamål.
Kritiska steg i protokollet
Vårt mål är att erhålla, karakterisera och lagra vävnader av god kvalitet som kommer från ämnen med detaljerad historia som härrör från longitudinell observation. För att nå detta mål krävs det att man tar itu med följande centrala aspekter. Som beskrivits ovan börjar protokollet med rekrytering av donatorer, vilket är det första avgörande steget. Sedan är det nödvändigt att givarna fortsätter uppföljningsprogrammet och upprätthåller vidhäftningen till projektet över tiden tills den faktiska donationen av hjärnan. Vid tidpunkten för dödsfallet är det nödvändigt att ABB-personalen omgående meddelas för att sammankalla obduktionsteamet inom 24 timmar, och vara viktigt för tillräcklig vävnadskvalitet. Färsk styckning av hjärnhalvorna kräver en stadig hand och en specifik träning. För att undvika cellskador orsakade av långsam frysning och erhålla skivor av god kvalitet för kryostaten och Omiken är det viktigt att de fryses ner snabbt. Med tanke på hastigheten för penetration av formalinlösning (1 mm/timme), för att bevara vävnadsdogenitet hålls blötläggningstiden för den enda skiva på sin lägsta nivå.
Felsökning av metoden
För att ta itu med de kritiska steg som nämns ovan erbjuder vi följande tillvägagångssätt. Givare rekrytering och anslutning till uppföljningar: Det finns flera faktorer som hindrar hjärnan donation inklusive rädsla för att skada kroppens figur, renhet och integritet, eller möjligheten att känna smärta efter döden. Vissa oroar sig till och med för att obduktionen kan genomföras medan de fortfarande lever70,71. Oron för störningar i begravningsarrangemangen och den ekonomiska bördan finns också72. Vidare kan en medicinsk personals brist på kunskap om förfaranden efter blödning och oförmågan att ta itu med de potentiella donatorernas eller deras NOK:s oro avskräcka från registrering. Alla dessa faktorer kan ge en låg grad av medvetenhet med ett lågt antal inskrivna deltagare och en stor möjlighet att givaren förlust över tiden. I själva verket bör givaren rekryteringsprogram vara effektiva för att sprida medvetenhet, ingjuta förtroende och övertyga människor att registrera och upprätthålla höga nivåer av uppföljning deltagande. Enligt vår erfarenhet sker detta genom noggrant urval av potentiella givare och grundlig förklaring av BB:s syften. Vi erbjuder pedagogiska aktiviteter och ett empatiskt tillvägagångssätt som tar itu med rädsla och behov hos både friska människor och de som drabbats av neurodegenerativa sjukdomar och deras familjer. Vi finner att potentiella givare är mer benägna att ge sitt samtycke när de kontaktas personligen. En face-to-face-strategi skapar en relation som bygger på ömsesidigt förtroende och respekt som är grundläggande för att uppnå en hög andel av registreringen till hjärnan donation och uppföljning bedömningar. En välutbildad personal med en stark känsla för etik först närmar sig den potentiella givaren, diskuterar möjligheten att donera hjärnan efter döden, förklarar värdet av mänsklig hjärnvävnad till neurovetenskaplig forskning, och klargör eventuella tvivel om postmortem förfaranden. Gynnsamma word of mouth är lika viktigt. Efter hjärnskörden ges lämplig uppmärksamhet och omsorg för att komponera om kadaver. Det är viktigt att visa respekt och tacksamhet till den avlidne genom att behandla kadaver försiktigt. Några månader efter, ett möte är planerad att kommunicera resultaten av den neuropatologiska analysen närhelst begärs av familjemedlemmar.
Tidpunkten för död och hjärnskörd: När personen accepterar, blir de en donator och får ett id-kort med ett nummer att kontakta 24 timmar/dag, 7 dagar/vecka (mottagningsnumret på ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital som är ansluten till oss). Dessutom ges en självhäftande tagg till de anhöriga som ska användas vid sjukhusvistelse. Begravningsbyråerna i området har tidigare informerats om att föra kroppen till ABB anläggningar, där obduktionen laget kallas. Obduktionsteamet består av en patolog, en neurolog och/eller en neurobiolog, och en anatomisk rumstekniker, som är jour från 6 till 23 varje dag; några trainee studenter är också ofta närvarande för att hjälpa och ta bilder.
Precisionen och konsekvensen hos de färska skärprocedurerna säkerställs genom medverkan av samma två operatörer (en neurolog och en patolog) som har utvecklat metoden och har flera års erfarenhet av neuropatologi. När fryser skivorna, de sätts på en prefrozen aluminium bricka och täckt med en samverkande aluminiumplatta för att hålla dem väl platt. Omedelbart efter sätts de i flytande kväve i 3 minuter, innan de förvaras vid -80 °C. De skivor som skall fastställas är individuellt insvept i gasväv, och indränkt i en 10% fosfat buffrad formalinlösning, som ersätts efter en dag. Därefter hålls de i formalin högst 5 ytterligare dagar; dock, med tanke på att formalinlösningen tränger in på 1 mm/dag, skulle vi vilja förkorta ytterligare blötläggningstiden.
Metodens begränsningar
Den forskningsmetod som beskrivs här omfattar endast ett begränsat geografiskt område, och de individer som deltar i donationsprogrammet besitter egenskaper som inte helt representerar den allmänna befolkningen. Även om det är mer än acceptabelt, kan ett postmortemintervall upp till 24 timmar producera förändringar i vissa proteinstrukturer, enzymer och RNA av hjärnvävnad. Fastställandet av AFS och pH kanske inte är helt tillräcklig för att bestämmavävnadskvalitet 73 och vi utvecklar andra sätt att autentisera vävnadskvaliteten baserat på RNA-integritet.
Angående förfarandet för mikrotomskärning, även om det är mycket användbart för att rekonstruera anatomiska samband, bör det noteras att användningen av makrosektioner inte är enkel och innebär vissa tekniska svårigheter. Vår metod är utmanande och tidskrävande. Kostnaderna är ganska höga och finansieringen är inte alltid lätt. Finansieringen kommer främst från offentliga (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) och privata resurser (Golgi-Cenci Foundation), privata donationer, ideella organisationer (t.ex. “Federazione Alzheimer Italia”) och beviljar deltagande.
ABB-metodens betydelse med avseende på befintliga/alternativa metoder
I början riktade vår hjärna donation program individer som deltar i InveCe.Ab longitudinella studien. Som en följd av detta åtföljs de hjärnor som doneras av detaljerad klinisk, biologisk och social information som samlats in genom åren. ABB:s styrka härrör just från detta särskiljande ursprung. Att studera en grupp socialt och genetiskt närstående personer som delar biologiska egenskaper och miljöexponeringar förbättrar statistisk analys. Dessutom innehåller studien följande fördelar: 1) Att ta hand om och sörja för samhällets behov (handlingen att “ge innan de frågar”): människor får en gratis periodisk kontroll som allmänläkaren är informerad om, ett telefonnummer till vår sekreterare tillhandahålls för samråd, och svårt funktionshindrade personer besöks hemma; 2) Engagerande deltagare, personer med offentliga roller och allmänläkare i pedagogisk verksamhet genom anordnande av periodiska seminarier (relaterade till hjärnans sundhet, hjärndonation och allmän hälsa), och planering av tematiska kurser (t.ex. användning av informationsteknik enheter för äldre); 3) Att träffa människor och anta en face-to-face-strategi. Alla dessa delar utgör styrkan i ABB-projektet. Vidare förbättrar projektet den kliniska förmågan hos involverad medicinsk personal, eftersom de får erfarenhet av både antemortembedömningar och eftermortem neuropatologiska utvärderingar. I detta avseende vill vi nämna den mycket egendomliga erfarenheten av “Minoritetens åldrande forskningsstudie”. Denna studie omfattade ett begränsat och utvalt antal afroamerikaner bosatta i Chicago-området (784 av 1.357 berättigade ämnen: svarsfrekvens på 57%). Deltagarna besöktes årligen hemma och ombads att gå med i programmet för hjärndonation. Denna studie är baserad på en ovanlig strategi med vissa likheter med vår få höga procentsatser av positivt svar på hjärnan donation programmet (352 givare av 784 deltagare var inskrivna: 44%), om än obduktionen var inte helt tillfredsställande (53%)74. Precis som i “Minoriteten åldrande forskningsstudie”, erbjuder vi pedagogiska aktiviteter och en empatisk strategi, att uppnå utmärkta resultat. I synnerhet är vår svarsfrekvens 93%, inskrivningsprocenten är 28,7%, och obduktionsfrekvensen för tillfället är 67%. Dessa priser visar att projekt som direkt engagerar människor har en mer betydande andel av donationer. Andra hjärnan donation program, med mindre uppmärksamhet i att bygga en relation med potentiella givare, i allmänhet har en låg inskrivning procent, är cirka 10-15%eller mindre 73,75.
Det finns få tidigare kohortstudier som slutar med en neuropatologisk analys. Dessutom är majoriteten av hjärnan banker och förråd sjukdomscentrerade och det finns en brist på “kontroll” hjärnor från friska givare jämfört med antalet “sjuka” hjärnor. Endast ett begränsat antal BBs baseras på befolkningsstudier som involverar både sjuka och normala försökspersoner för att kunna studera åldrandebanor 73,74,76,77,78,79,80. Vissa studier som Minoritetens åldrande forskningsstudie i USA74 och The Vanda 85+ studien i Finland76 liknar vår men de tenderar att ta i och med att kohorten upphör. Istället är ABB: s donation program tänkt att fortsätta under en lång tid i framtiden, värva potentiella givare och schemaläggning uppföljningar även efter utgången av InveCe.Ab longitudinella studien. Detta tillvägagångssätt gör vår rekryteringsmetod liknar den i “Sun Health Research Institute (SHRI) hjärnan donation program” som syftar till en pensionering gemenskap73. Shri-protokollet för hjärndonation är mycket effektivt med det kortaste medelvärdet postmortemintervall i världen (3,92 timmar). I likhet med de största BBs i världen, SHRI protokollet helt enkelt klippa storhjärnan, lillhjärnan och hjärnstammen i mittlinjen (sagittal plan), då ena halvan är dissekeras färska och frysta för biokemiska studier, medan den andra är fast i formalin för histopatologisk bedömning. En av styrkorna med SHRI-dissektionsprotokollet är dock fixeringen av enskilda skivor i stället för hela halvklotet. Faktum är att fixera en halvklot som helhet är inte optimalt, på grund av de olika fixeringsgradienterna mellan ytan och kärnan. Dessutom kan de kortikala proteinerna påverkas av långvarig exponering för formalinlösningen. Således, anledningen till att vi beslutat att fixa enskilda skivor.
Beslutet om vilken sida som är fast eller fryst, beror på singularbanken (alltid samma, slumpmässigt tilldelade eller tilldelade beroende på om dissekeringsdagen är udda eller jämn)31,32,33,34,35. Så, biokemiska och histopatologisk analys utförs separat på varje halvklot. Eftersom många neurologiska sjukdomar är asymmetriska, erbjuder vår BB ett unikt protokoll för skivning av färska exemplar: alternativa sektioner från hjärnstammen och från varje halvklot av lillhjärnan och cerebrum behålls som fast eller fryst material; ett fast segment på en halvsfär motsvarar en fryst på den andra hjärnhalvan. Vår metod ger möjlighet att få en komplett histologisk karakterisering av allt fruset material och att jämföra resultaten från alla områden på båda sidor. Som sagt i inledningen, den metod som beskrivs tillåter oss att få så mycket information som möjligt från hjärnvävnaden. Vidare ger ABB: s metod en grundläggande men komplett neuropatologiska karakterisering, inklusive nästan alla kända hjärnan proteinopathies och vaskulär patologi. På grund av den kontroversiella roll vaskulära skador vid fastställandet av kognitiv svikt, vi beslutat att använda en dubbel scoring förden vaskulära bördan 30,53.
Som förklaras i protokollet använder vi oss av ett tvärvetenskapligt tillvägagångssätt. Även om detta är en tidskrävande och ansträngd metod, tror vi att det ger flera fördelar för forskning. Till exempel, i ett tidigare arbete, visade vi att hög tHcy i sig, eller MTHFR C677T TT i samband med APOE-ε4 allel, kan vara relaterade till verkställande dysfunktioner snarare än minnesförlust81. Därför kan det vara intressant att utvärdera ämnen med just denna genetiska profil på en neuropatologisk nivå. Detta är ett exempel på hur en sådan fördjupad uppföljning är användbar för att skapa nya forskningshypoteser som kan verifieras genom utredning av biologiskt material som samlats in i vår bank. En annan demonstration av fördelen med vårt tillvägagångssätt är införandet av QEEG bland de bedömningar vi rutinmässigt utför, för sin originalitet och den relativa användarvänligheten. I själva verket upptäcker EEG den synaptiska aktiviteten i hjärnbarken genom att registrera de elektriska potentialerna för dendrites som tillhör när pyramidala nervceller82. QEEG kan anses vara en biomarkör för uppskattning av när synaptisk aktivitet som är relaterad till kognition83. Särskilt har en minskning av alfa rytmer i den bakre delen av hjärnan med en allmän ökning av lägre frekvenser (theta och delta rytmer) varit relaterade till när anslutning uppdelning. Det bör anses att de flesta av de diagnostiska korrelationsstudierna har baserats på en klinisk diagnos som bara är en trolig och inte en bestämd diagnos84,85,86,87. Endast mycket få riktade studier har jämfört QEEG-data med den neuropatologiska bilden för att undersöka sambandet mellan QEEG och LTS-varianterna88,89, och skillnaden mellan FTLD och AD83. Genom att avsluta vår studie med en definition av den neuropatologiska diagnosen är det då möjligt att korrekt tolka de observationer som gjorts på cerebral elektrisk aktivitet. Dessutom utför seriella QEEG i varje ämne kan vi spåra intra-individuella EEG vågor bana och deras korrelationer med neuropatologiska bilden. Efter enskilda modifieringar av när elektrisk aktivitet över tiden kan leda till en bättre förståelse av dess innebörd som en biomarkör för begynnande demens.
Framtida tillämpningar och riktning av metoden
Att implementera vävnadsfördelningen är ett av våra viktigaste prospektiva mål. För att göra detta, vi just inrättat en vetenskaplig kommission inklusive direktören för GC Foundation (geriatriker), en akademiker i Neurology från universitetet i Pavia, en neurolog och en patolog både från GC Foundation & den geriatriska sjukhuset ASP Golgi-Redaelli. Vid distribution av hjärnvävnad, histologiska diabilder och andra biologiska prover är det viktigt att komma ihåg att givarna gick med på donationen för forskningens skull. Materialdistributionen bör därför ske försiktigt, precis som beskrivs i BNE:s uppförandekod40. Varje part som lämnar in en begäran om material bör ange typ och mängd av det prov som behövs, ge en beskrivning av forskningsprojektet och hur proverna kommer att användas, och när så är möjligt, lämna bevis på tidigare publikationer (för överlåtelseavtalet, se figur 9). Hjärnbanken fungerar inte för ekonomisk vinning. Så bör de avgifter som betalas av forskare endast täcka kostnaderna för vävnadsanskaffning, bearbetning, lagring och distribution.
Planer på att börja analysera fall med exome sekvensering och Omics tekniker, såsom proteomik och transkriptomik, är i rörelse. Vår alternativa provtagningsmetodik gör det möjligt att utföra omikstudier på histologiskt väldefinierade vävnader från båda halvkloten. Genom detta tillvägagångssätt kommer det att vara möjligt att jämföra mönstret för genaktivering i olika hjärnområden på samma halvklot och i motsvarande områden i den andra hjärnhalvan, och kunna korrelera genaktivering med histopatologi. Inom detta område, skulle djupinlärning applikationer vara av stort intresse inklusive datoriserad analys av histologiska diabilder och banbrytande korrelation av kliniska, histologiska och omics data. Andra samband mellan många olika variabler kan identifieras liksom andra möjliga tekniska tillämpningar. Tillgången på fryst material från båda halvkloten kommer att möjliggöra en korrekt topografi av genaktivering och proteinfördelning. Detta kommer att vara av särskilt intresse även i friska försökspersoner, med tanke på att både hjärnans funktioner och vissa sjukdomar är asymmetriska.
Dessutom kan vi få cellkulturer från väl karakteriserade hjärndonatorer. Faktum är att cellkulturer från leptomeninges av skördade hjärnor leverera levande celler som kan användas för ytterligare undersökning av sjukdomar eller åldrande mekanismer, med hjälp av de inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) teknik som innebär omprogrammering leptomeningeal fibroblaster och differentiera dem till neurala celler i avancerade modeller90.
Som hjärnor ålder, olika profiler av förändring kan uppstå på molekylär, cellulär och vävnad nivå. Varje hjärna är unik. Var och en har sitt eget sätt att reagera på interna och externa stressfaktorer; vissa motstår medan andra dukar under och visar distinkta patologier. Diskrepanser mellan den kliniska presentationen och den neuropatologiska bilden finns ofta eftersom topografin av skador, snarare än deras molekylära karaktär, bestämmer den kliniska presentationen. korrekt och bestämd diagnos kunde endast uppnås genom att kombinera det kliniska syndromet med de neuropatologiska resultaten som ofta lägger till viktiga etiologiska ledtrådar som krävs för att reda ut patogenesen vid sjukdomarna. I Europa finns en strävan att skapa en standardmetod för neuropatologisk diagnos. Vårt diagnostiska protokoll följer nästan helt de nyligen publicerade riktlinjerna om neuropatologisk diagnos för brain banking91. Detta kommer att tillåta oss att samla in och dela väldokumenterad hjärnvävnad, med det prospektiva målet att etablera den första italienska Brain Bank. I Italien finns det faktiskt hjärnregister men inte hjärnbanker baserade på kohortstudier. Vårt mål är att utveckla en metod för hjärnvävnadsskörd som kan implementeras brett i hela Italien, att etablera ett nätverk som använder ett gemensamt protokoll och delar jämförbart material. För att kunna göra det är medverkan av andra forskningscentra och skapandet av en specifik webbplats bland de viktigaste målen för framtiden.
Innovativ teknik används ständigt för analys av neurodegenerativa sjukdomars molekylära natur och för identifiering av biomarkör. I detta sammanhang kommer det att finnas ett ökande behov av hjärnor åtföljs av information om kognitiva och åldrande banor som erhållits genom longitudinella studier, betonar vikten av en neuropatologiskt verifierad epidemiologisk strategi92.
The authors have nothing to disclose.
Vi önskar att tillägna detta arbete till Dr.ssa Michela Mangieri. Innan hon dog i förtid, hon tänkt och startade Abbiategrasso Brain Bank Project.
Vi är tacksamma mot våra hjärndonatorer, som generöst bidrar till forskning donerar den ädlaste organ i sin kropp; utan dem skulle denna forskning inte vara möjlig.
Vi är tacksamma mot Valeria Marzagalli för hennes dyrbara arbete i ABB-projektet.
Författarna tackar prof. Johannes Attems, Dr Paolo Fociani och Dr Giorgio Giaccone för deras dyrbara vägledning och kloka råd.
Vi vill tacka Dr.ssa Alice Cirrincione och Miss Giulia Bortone för deras dyrbara hjälp under hela projektet.
Ett stort tack till Fru Tere Cassani för hennes stöd och till “Federazione Alzheimer Italia” för sitt samarbete.
Författarna är tacksamma mot Dr Matteo Moretti och prof. Antonio Marco Maria Osculati, Institutionen för folkhälsa, experimentell och rättsmedicin, University of Pavia.
50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
Cutting board | BD | 352070 | |
DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
Ethylether | SMI | 8401530 | |
Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
Gloves | CEA | 01.28.14 | |
Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
Head supporter | Lacor | 60456 | |
L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
Sterile scalpel with n°21 blade | |||
Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
Feather | M130RC |