Experimentele aanpak voor het onderzoeken van leptine signalering in de carotis lichamen en de effecten ervan op de controle van de ademhaling
Summary
Onze studie richt zich op de effecten van leptine signalering in carotis lichaam (CB) op de hypoxische-ventilatoire respons (HVR). We uitgevoerd ‘ verlies van functie ‘ experimenten meten van het effect van leptine op HVR na CB denervatie en ‘ winst van functie ‘ experimenten meten HVR na overexpressie van de leptine receptor in CB.
Abstract
Een adipocyte-geproduceerde hormoon leptine is een krachtige respiratoire stimulerende middelen, die een belangrijke rol kunnen spelen bij het verdedigen van de ademhalingsfunctie bij obesitas. De carotis lichamen (CB), een belangrijk orgaan van perifere hypoxische gevoeligheid, uitdrukken de lange functionele isovorm van leptine receptor (leprb) maar de rol van leptine signalering in de controle van de ademhaling is niet volledig opgehelderd. We onderzochten de hypoxische ventilatorrespons (HVR) (1) in C57BL/6J-muizen voor en na leptine-infusie bij baseline en na de denervatie van CB; (2) in Leprb-deficiënte zwaarlijvige db/DB muizen bij baseline en na Leprb overexpressie in CBs. In C57BL/6J muizen, leptine verhoogd HVR en effecten van leptine op HVR werden afgeschaft door CB denervation. In db/DB -muizen verhoogde de leprb -expressie in CB de HVR. Daarom concluderen we dat leptine in CB werkt om reacties op hypoxie te vergroten.
Introduction
Een adipocyte geproduceerd hormoon leptine handelt in de hypothalamus te onderdrukken van voedselinname en verhoging van de stofwisseling. Studies uitgevoerd in ons laboratorium1,2 en door andere onderzoekers3,4 toonde aan dat leptine verhoogt de hypercapnic ventilatoire respons (HVR) voorkomen van obesitas hypoventilatie in leptine gebrekkige obesitas. Echter, een meerderheid van zwaarlijvige individuen hebben hoge plasma leptine niveaus en demonstreren weerstand tegen de metabole en respiratoire effecten van het hormoon5,6,7,8. Resistentie tegen leptine is multifactoriële, maar beperkte permeabiliteit van de bloed-hersen barrière (BBB) aan leptine speelt een belangrijke rol. Wij stellen voor dat leptine handelt onder BBB in een belangrijk orgaan van perifere hypoxische gevoeligheid, de carotis lichamen (CB), om de ademhaling in zwaarlijvige individuen te verdedigen. CBs Express de lange functionele isovorm van leptine receptor, leprb, maar de rol van CB in de Ademhalings effecten van leptine is niet voldoende opgehelderd9,10.
Het doel van onze methode was om het effect van leptine signalering in de CB op HVR te onderzoeken. Onze redenering was het uitvoeren van (a) verlies van functie-experimenten die leptine in muizen met intact carotis lichamen en denervated carotis lichamen gevolgd door HVR metingen; b) winst van functie-experimenten in db/DB -Muizen zonder leprb, waarin we de HVR op baseline en na uitdrukking van LEPRb uitsluitend in CB hebben gemeten. Het voordeel van onze technieken was dat we al onze experimenten uitgevoerd in ongefixeerde unanesthetized muizen tijdens de slaap en wakkerheid. Vorige onderzoekers ofwel uitgevoerd hun experimenten onder anesthesie9 of niet meten van de effecten van leptine tijdens de slaap10. Daarnaast is onze studie de eerste die gebruik maakt van een unieke winst van functie benadering met selectieve LepRb -expressie in CB zoals hierboven beschreven.
In de brede context, onze aanpak kan worden gegeneraliseerd naar andere receptoren uitgedrukt in CB en hun rol in hypoxische gevoeligheid. Onderzoekers kunnen een ligand aan een receptor van belang en meet de HVR op baseline en na CB denervation. Als een complementaire aanpak kan een receptor van belang worden overuitgedrukt in CB en HVR metingen kunnen worden uitgevoerd voor en na overexpressie met behulp van onze technologie beschreven in dit manuscript.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste focus van onze studie was het onderzoeken van respiratoire effecten van leptine signalering in de CB. Verschillende protocollen zijn ontwikkeld om de rol van leptine op een mechanistische manier te beoordelen. Eerste, specifieke bijdrage van CB aan de HVR werd geanalyseerd door zorgvuldige kwantificering van de HVR tijdens de eerste 2 min van hypoxische blootstelling. Ten tweede, de relevantie van CB in leptine-gemedieerde up-regulering van de controle van de ademhaling werd onderzocht door twee compleme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025
Materials
| 1ml Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| 1x PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | 500 ml |
| Ad-Lacz | Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) | 1×1010 pfu/ml | |
| Ad-LepRb-GFP | Vector Biolabs | ADV-263380 | 2-5×1010 pfu/ml |
| Anesthetic cart | Atlantic Biomedical | ||
| Betadine | Purdue Products Ltd. | 12496-0757-5 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 0.3mg/ml |
| C57Bl/6J | Jackson laboratory | 000664 | Mice Strain |
| Cotton Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| db/db | Jackson laboratory | 000697 | Mice Strain |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Lab Chart | Data Science International (DSI) | Software | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| Micro Spring Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14124 | |
| Mouse Ox Plus | STARR Life Sciences Corp. | Software | |
| Mouse Ox Plus Collar Sensor | STARR Life Sciences Corp. | 015022-2 | Medium Collar Clip Special 7” |
| Mouse Whole Body Plethysmography Chamber | Data Science International (DSI) | PLY3211 | |
| Ohio Care Plus Incubator | Ohmeda | HCHD000173 | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 501753-G | Straight |
| Osmotic Pump | Alzet | 1003D | 1ul per hour, 3 days |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| Recombinant Mouse Leptin protein | R&D systems | 498-OB-05M | 5mg |
| Saline | RICCA Chemical | 7210-16 | 0.9% Sodium Chloride |
| Sterile Surgical Suture | DemeTech | DT-639-1 | Silk, size 6-0 |
| Thermometer | Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) | EW 20250-91 |
References
- O’donnell, C. P., et al. Leptin prevents respiratory depression in obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).
- Polotsky, V. Y., et al. Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).
- Bassi, M., et al. Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).
- Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus. Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).
- Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).
- Maffei, M., et al. Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).
- Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity. Thorax. 57, 75-76 (2002).
- Berger, S., Polotsky, V. Y. Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947 (2018).
- Ribeiro, M. J., et al. High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity. The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).
- Yuan, F., et al. Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression. Frontiers in Physiology. 9, 249 (2018).
- Caballero-Eraso, C., et al. Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response. The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).
- Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).
- Polotsky, V. Y., et al. Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control. Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).
- Pho, H., et al. The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse. Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).
- Hernandez, A. B., et al. Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse. Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).
- Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. Time domains of the hypoxic ventilatory response. Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16, 81-87 (1955).
- Duffin, J. Measuring the ventilatory response to hypoxia. The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).
- Teppema, L. J., Dahan, A. The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis. Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).
- Nurse, C. A., Fearon, I. M. Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture. Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).
- Kumar, P., Prabhakar, N. R. Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body. Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).
- Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat. The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).
