Экспериментальный подход к изучению лептина сигнализации в сонной телах и его влияние на контроль дыхания
Summary
Наше исследование фокусируется на воздействии лептина сигнализации в сонной артерии (CB) на гипоксической вентиляционной реакции (HVR). Мы провели эксперименты «потеря функции», измеряя влияние лептина на HVR после денервации ЦБ и «выгоды функции» экспериментов, измеряя HVR после переэкспрессии рецептора лептина в ЦБ.
Abstract
Адипоцит производства гормона лептина является мощным стимулятором дыхания, который может играть важную роль в защите дыхательной функции при ожирении. Сонных тел (CB), ключевой орган периферической гипоксической чувствительности, выразить длительный функциональный изоформы рецептора лептина (LepRb), но роль лептина сигнализации в контроле дыхания не была полностью выяснена. Мы изучили гипоксический вентиляционный ответ (HVR) (1) у мышей C57BL/6J до и после вливания лептина на базовом уровне и после денервации ЦБ; (2) в LepRb-дефицитных тучных дБ/дб мышей на базовом уровне и после переэкспрессии LepRb в CBs. У мышей C57BL/6J, лептин увеличил HVR и эффекты лептина на HVR были отменены денервацией CB. В db/db мышей, LepRb выражение в CB увеличило HVR. Таким образом, мы делаем вывод, что лептин действует в ЦБ для увеличения реакции на гипоксию.
Introduction
Адипоцит производится гормон лептин действует в гипоталамусдляе для подавления прием пищи и увеличение скорости обмена веществ. Исследования, проведенные в нашей лаборатории1,2 и другими следователями3,4 показали, что лептин увеличивает гиперкапный вентиляционный ответ (HVR) предотвращения ожирения гиповентиляции в лептине неполноценного ожирения. Тем не менее, большинство людей, страдающих ожирением имеют высокий уровень плазмы лептина и демонстрируют устойчивость к метаболическим и респираторным эффектам гормона5,6,7,8. Сопротивление лептину является многофакторным, но ограниченная проницаемость гематоэнцефалического барьера (BBB) к лептину играет важную роль. Мы предлагаем, чтобы лептин действует ниже BBB в ключевом органе периферической гипоксической чувствительности, сонных тел (CB), чтобы защитить дыхание у людей с ожирением. ЦБ выражают длинную функциональную изоформу рецептора лептина, LepRb, но роль ЦБ в респираторных эффектах лептина недостаточно прояснена9,10.
Целью нашего метода было изучение влияния лептина сигнализации в ЦБ на HVR. Наше обоснование состояло в том, чтобы выполнять (а) потерю функциональных экспериментов, вливающих лептин у мышей с нетронутыми сонной артерией и денерватированными сонной артерией, за которыми следуют измерения HVR; b) увеличение функциональных экспериментов на дб/дб мышах, не хватает LepRb, в которых мы измеряли HVR на базовом уровне и после выражения LepRb исключительно в ЦБ. Преимуществом наших техник было то, что мы проводили все наши эксперименты на безудержных безобездененных мышах во время сна и бодрствования. Предыдущие исследователи либо проводили свои эксперименты под наркозом9, либо не измеряли эффекты лептина во время сна10. Кроме того, наше исследование является первым использовать уникальный прирост функционального подхода с селективным выражением LepRb в CB описано выше.
В широком контексте, наш подход может быть обобщен к другим рецепторам, выраженным в ЦБ и их роль в гипоксической чувствительности. Следователи могут наполнить лиганд рецептором интереса и измерить HVR на базовом уровне и после денервации ЦБ. В качестве дополнительного подхода, рецептор интереса может быть перевыражен в CB и HVR измерения могут быть выполнены до и после переэкспрессии с использованием нашей технологии, описанной в этой рукописи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основное внимание в нашем исследовании было уделено изучению респираторных эффектов сигналиции лептина в ЦБ. Для оценки роли лептина в механистической манере было разработано несколько протоколов. Во-первых, конкретный вклад ЦБ в HVR был проанализирован путем тщательной количественно…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025
Materials
| 1ml Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| 1x PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | 500 ml |
| Ad-Lacz | Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) | 1×1010 pfu/ml | |
| Ad-LepRb-GFP | Vector Biolabs | ADV-263380 | 2-5×1010 pfu/ml |
| Anesthetic cart | Atlantic Biomedical | ||
| Betadine | Purdue Products Ltd. | 12496-0757-5 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 0.3mg/ml |
| C57Bl/6J | Jackson laboratory | 000664 | Mice Strain |
| Cotton Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| db/db | Jackson laboratory | 000697 | Mice Strain |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Lab Chart | Data Science International (DSI) | Software | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| Micro Spring Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14124 | |
| Mouse Ox Plus | STARR Life Sciences Corp. | Software | |
| Mouse Ox Plus Collar Sensor | STARR Life Sciences Corp. | 015022-2 | Medium Collar Clip Special 7” |
| Mouse Whole Body Plethysmography Chamber | Data Science International (DSI) | PLY3211 | |
| Ohio Care Plus Incubator | Ohmeda | HCHD000173 | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 501753-G | Straight |
| Osmotic Pump | Alzet | 1003D | 1ul per hour, 3 days |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| Recombinant Mouse Leptin protein | R&D systems | 498-OB-05M | 5mg |
| Saline | RICCA Chemical | 7210-16 | 0.9% Sodium Chloride |
| Sterile Surgical Suture | DemeTech | DT-639-1 | Silk, size 6-0 |
| Thermometer | Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) | EW 20250-91 |
References
- O’donnell, C. P., et al. Leptin prevents respiratory depression in obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).
- Polotsky, V. Y., et al. Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).
- Bassi, M., et al. Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).
- Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus. Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).
- Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).
- Maffei, M., et al. Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).
- Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity. Thorax. 57, 75-76 (2002).
- Berger, S., Polotsky, V. Y. Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947 (2018).
- Ribeiro, M. J., et al. High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity. The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).
- Yuan, F., et al. Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression. Frontiers in Physiology. 9, 249 (2018).
- Caballero-Eraso, C., et al. Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response. The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).
- Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).
- Polotsky, V. Y., et al. Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control. Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).
- Pho, H., et al. The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse. Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).
- Hernandez, A. B., et al. Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse. Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).
- Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. Time domains of the hypoxic ventilatory response. Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16, 81-87 (1955).
- Duffin, J. Measuring the ventilatory response to hypoxia. The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).
- Teppema, L. J., Dahan, A. The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis. Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).
- Nurse, C. A., Fearon, I. M. Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture. Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).
- Kumar, P., Prabhakar, N. R. Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body. Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).
- Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat. The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).
