Oprichting en karakterisering van de neuro-endocriene tumor Spheroids van de kleine darm
Summary
Neuro-endocriene tumoren (netten) zijn afkomstig van neuro-endocriene cellen van de neurale Crest. Ze zijn traag groeiend en uitdagend voor cultuur. We presenteren een alternatieve strategie om netten van de dunne darm te kweken door ze als spheroids te kweken. Deze sferoïden hebben kleine darmen net markers en kunnen worden gebruikt voor het testen van de drug.
Abstract
Kleine darm neuroendocriene tumoren (SBNETs) zijn zeldzame kankers afkomstig van enterochromaffin cellen van de darm. Onderzoek op dit gebied is beperkt omdat er zeer weinig patiënt afgeleide SBNET cellijnen zijn gegenereerd. Goed gedifferentieerde SBNET cellen zijn traag groeien en zijn moeilijk te propageren. De weinige cellijnen die zijn vastgesteld zijn niet direct beschikbaar, en na de tijd in de cultuur mag niet blijven om de kenmerken van de netto-cellen uit te drukken. Het genereren van nieuwe cellijnen kan vele jaren duren, omdat SBNET-cellen een lange verdubbelingstijd hebben en veel verrijkingsstappen nodig zijn om de snel delende kankergerelateerde fibroblasten te elimineren. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een protocol ontwikkeld om sbnet-cellen te kweken van operatief verwijderde tumoren als sferoïden in extracellulaire matrix (ECM). De ECM vormt een 3-dimensionale matrix die SBNET-cellen inkapt en de tumor micro-omgeving nabootst voor het laten groeien van SBNET-cellen. Hier kenmerkten we de groeisnelheid van sbnet sferoïden en beschreven methoden om sbnet-markers te identificeren met behulp van immunofluorescentie microscopie en immunohistochemie om te bevestigen dat de sferoïden neuroendocriene tumorcellen zijn. Daarnaast gebruikten we sbnet sferoïden voor het testen van de cytotoxiciteit van rapamycine.
Introduction
Kleine darm neuroendocriene tumoren (SBNETs) zijn afkomstig van enterochromaffin cellen van de dunne darm. Hoewel sbnets over het algemeen bekend zijn dat ze langzaam groeien, metastaseren ze vaak naar de lever1. Terwijl de chirurgische verwijdering of tumor ablatie kan worden overwogen in veel gevallen, herhaling is bijna universeel, en, daarom, medische therapie speelt een belangrijke rol in het management. Er zijn enorme inspanningen geïnvesteerd om nieuwe SBNET-cellijnen voor het testen van geneesmiddelen te genereren. Er is echter weinig succes geboekt. Slechts 6 sbnetcellijnen (krj-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) zijn gemeld2,3,4,5; en helaas is één cellijn niet langer NET markers6 en drie andere sbnet cellijnen (krj-I, L-STS, H-STS) die zijn vastgesteld om te worden afgeleid van getransformeerde lymfoblasten in plaats van netten7. Om de identificatie van geneesmiddelen voor het targeten van SBNETs te versnellen, zijn alternatieve methoden voor in-vitro geneesmiddelen tests nodig.
Hier maken we gebruik van de beschikbaarheid van nieuwe sbnets en hebben we een manier gecreëerd om deze door patiënten afgeleide sbnets te kweken als sferoïden in ECM. Het algemene doel van dit manuscript is om een methode te beschrijven voor cultuur sbnet als een driedimensionale (3D) cultuur en overzichts procedures om deze sferoïden te karakteriseren voor het bewaren van sbnet markers door immunofluorescentie kleuring en immunohistochemie.
Daarnaast tonen we aan hoe deze sbnet sferoïden kunnen worden gebruikt voor het testen van het effect van rapamycine, een anti-kanker medicijn voor NETs8. De achterliggende gedachte achter dit protocol is om een nieuwe methode te ontwikkelen om SBNET-cellen in vitro te laten groeien en deze te gebruiken voor het testen van medicijnen. Het voordeel van deze techniek ten opzichte van de traditionele methode voor het opzetten van een SBNET-cellijn is dat 3D-culturen van SBNETs snel kunnen worden verkregen en dat geneesmiddelen testen binnen 3 weken kunnen worden uitgevoerd. Sbnet sferoïden kan mogelijk worden gebruikt als model voor het uitvoeren van in vitro geneesmiddelen schermen om nieuwe geneesmiddelen voor sbnet-patiënten te identificeren. Aangezien sbnet-cellijnen niet algemeen beschikbaar zijn, kunnen 3D-culturen van sbnet-sferoïden fungeren als een nieuw in vitro model voor het bestuderen van sbnets en kunnen worden gedeeld door wetenschappers in het veld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumor 3D culturen zijn uitgegroeid tot een waardevolle bron voor preklinische drug testen15. Verschillende tumor organoïde biobanken zijn onlangs opgericht uit borstkanker en prostaatkanker tumoren16,17. In deze studie bieden we een gedetailleerd protocol aan cultuur-SBNET als sferoïden en een eenvoudige en snelle methode om de spheroid-culturen voor netto-markers te valideren door immunofluorescentie en test geneesmiddel gevoeligheid. V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door NIH grants P50 CA174521 (aan J.R. Howe en A.M. Bellizzi). P.H. ear is een ontvanger van de P50 CA174521 Career Enhancement Program Award.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines – P-STS, L-STS, H-STS – derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line–letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
