초파리 비행 근육은 전사 조절, 대체 접합, 신진 대사 및 메카노생물학을 연구하는 강력한 모델입니다. 우리는 프로테오믹스및 깊은 시퀀싱에 이상적인 고농축 샘플을 생성하기 위해 살아있는 번데기에서 형광 표지된 비행 근육의 해부를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 견본은 근육 발달의 다양한 양상에 중요한 기계론적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Drosophila 비행 근육은 전사 조절, 대체 접합, 신진 대사 및 기계생물학과 같은 다양한 과정을 연구하는 강력한 모델이며, 이는 모두 근육 발달과 근생 신생에 영향을 미칩니다. 질량 분석 또는 깊은 시퀀싱에 의해 생성된 Omics 데이터는 이러한 생물학적 프로세스에 대한 중요한 기계적 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이러한 접근법의 경우, 조직 특이적 샘플을 분석하여 오믹스 지문의 선택성과 특이성을 모두 증가시키는 것이 유익하다. 여기에서 우리는 omics 응용을 위한 높게 풍요로운 근육 견본을 생성하기 위하여 살아있는 pupae에서 형광 표지한 비행 근육의 해부를 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 먼저 초기 pupal 단계에서 비행 근육을 해부하는 방법을 설명 (&48 번화 증형성 후 시간 [APF]), 근육은 녹색 형광 단백질에 의해 식별 할 때 (GFP) 라벨. 그런 다음 근육이 해부 현미경으로 구별 될 때 늦은 번데기 (>48 h APF) 또는 성인에서 근육을 해부하는 방법을 설명합니다. 동반 된 비디오 프로토콜은 기술적으로 요구하는 해부를 근육과 초파리 연구 커뮤니티에 보다 광범위하게 접근 할 수 있게 합니다. RNA 적용을 위해, 우리는 다른 시점에서 그리고 다른 접근으로 격리될 수 있는 RNA의 양 그리고 질을 분석합니다. 우리는 또한 Bruno1 (Bru1)가 myosin 중계체인(Mhc)접합의 시간적 변화에 필요하다는 것을 보여주고, 해부 된 근육이 mRNA-Seq, 질량 분석 법 및 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)에 사용될 수 있음을 입증합니다. 응용 프로그램. 이 해부 프로토콜은 조직 특이적 오믹스 분석을 촉진하는 데 도움이 되며 일반적으로 근생의 여러 생물학적 측면을 연구하기 위해 적용될 수 있습니다.
현대 omics 기술은 근육 발달과 인간의 근육 장애의 근본적인 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 예를 들어, 동물 모델에서 유전적 및 생화학적 검증과 결합된 전사체 데이터의 분석은 결합 인자 RBM20의 손실이 30개 이상의 sarcomere의 표적 네트워크의 조절로 인해 확장된 심근병증을 유발한다는 것을 밝혀냈습니다. 이전에 심장 질환과 관련된 유전자, 티틴을포함1,2,3.
두 번째 예에서, 세포 배양, 동물 모델 및 인간 환자로부터의 연구는 근위축증이 MUSCLEblind(MBNL)의 격리 및 CELF14,5의상류조절로 인한 RNA 조절의 붕괴에 기인한다는 것을 보여주었다. MBNL과 CELF1 (CUGBP1 또는 Bruno-Like 2라고도 함) 사이의 교차 조절 및 시간 적 역학은 근위축증 환자의 지속적인 배아 접합 패턴을 설명하는 데 도움이됩니다. 추가적으로, 잘못 규제된 표적의 큰 네트워크는 질병의 복잡한 본질을 설명하는 것을 돕습니다4,6,7,8. 그 같은 연구 결과의 대다수는 인간 적인 근육 질병의 근본적인 기계장치를 이해하기 위하여 유전 모형 유기체에 있는 omics 접근을 이용합니다. 또한, 그들은 질병이나 노화 근육의 변화를 이해하기 위해 건강한 근육의 시간적 및 조직 유형 특정 유전자 발현, 단백질 수정 및 대사 패턴을 먼저 이해하는 것의 중요성을 강조합니다.
초파리 멜라노가스터는 또 다른 잘 확립된 유전 모델 유기체입니다. 사르코레의 구조와 개별 사르코망 성분은 파리에서 척추동물4,9,10으로매우 보존되며 간접 비행 근육(IFMs)은 연구할 수 있는 강력한 모델이 되었습니다. 근육 발달의 여러 측면11,12. 첫째, 섬유질 비행 근육은 기능적으로 그리고 형태학적으로 관형 신체근육과 구별11,13,근육 형 특정 발달 메커니즘의 조사를 허용. 스팔트 메이저(Salm)14,엑스트라덴티클(Exd), 호모토락스(Hth)15를 포함한 전사 인자는 세브릴라 운명 조절자로 확인되었다. 또한, 살름의 하류, CELF1 호몰로그 Bruno1 (Bru1, Aret)은 세브릴라 특이적 접합 프로그램16,17을지시한다.
둘째, IFM은 근형성 융합 및 myotube 부착부터 근위대 유족발생 및 사코메르 성숙9,18,19에이르기까지 근형성 자체의 과정을 이해하는 중요한 모델이다. 셋째, Drosophila 유전학은 sarcomere 형성, 기능 및 생물 물리학적 특성에 개별 단백질, 단백질 도메인 및 단백질 이소폼에 의한 기여의 조사를허용합니다 20,21,22 ,23. 마지막으로, IFM 모델은 근위축증, 근시근균, 근육퇴행성 질환, 작용병증 등과 같은 다중 인간 근육 장애의 연구를 위해 개발되었으며,24,25,26 ,27, 질병 메커니즘 및 잠재적 치료법에 대한 중요한 통찰력을 제공28,29,30. 따라서, Drosophila는 근육 형 특이적 전사, 접합 및 염색질 조절의 메커니즘뿐만 아니라 근육 발달에서 신진 대사의 역할을 포함하여 근형성 분야에서 많은 열린 질문을 해결하는 유용한 모델입니다. 현대 오믹스 기술의 적용, 특히 다양한 유전적, 생화학적 및 세포 생물학적 분석을 통해 Drosophila에서사용할 수 있는, 근육의 이해를 극적으로 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 개발, 노화 및 질병.
IFM은 비행에서 가장 큰 근육이며, 성인31,32의흉부 전체 길이에 걸쳐 거의 1mm에 걸쳐 있습니다. 그러나, 이러한 작은 크기는 조직 형 특이적 방식으로 Drosophila에서 오믹 기술을 적용하기에 충분한 샘플을 얻는 도전을 생성한다. 또한 IFM은 푸팔 단계 중에 형성되는 성인 근육의 일부입니다. 근체세포는 근체튜브를 형성하기 위해 융합되며, 이는 puparium 형성 후 약 24시간 동안 힘줄에 부착하고 30h APF(그림 1A-D)18,33,30h APF 주위의 근위병 발생을 개시하는 데 필요한 다짐 단계를 거칩니다. 34.
myofibers는 약 48 h APF까지 sarcomere 추가에 초점을 맞춘 초기 성장 단계를 겪고, 흉부의 전체 길이에 걸쳐 성장, 다음 성숙 단계로 전환, 있는 sarcomeres 길이와 폭에서 성장 하 고 72 h APF(그림 1A-D)32,35에의해 스트레치 활성화를 설정하기 위해 리모델링. 섬유 성숙의 개시는 적어도 부분적으로 Salm 및 E2F32,36,37에의해 통제되고, 그 접합이 Bru1에 의해 통제되는 다중 IFM 특이적인 sarcomere 단백질 이소폼은 이 기간 동안 통합됩니다 단계16,17. 성숙한 파리는 90-100 h APF에서 닫힙입니다. 즉, 근육 발달을 연구하기 위해 IFM은 오믹스 접근법을 사용하여 분석을 용이하게 하기 위해 여러 pupal 타임포인트에서 충분한 양, 품질 및 순도로 격리되어야 합니다.
IFM 해부를 위한 몇 가지 프로토콜이 게시되었습니다. 이러한 프로토콜은 의도된 응용 프로그램에 적합하지만 omics 접근 방식에 이상적인 프로토콜은 없습니다. 푸팔 및 성인 IFM19의면역형광에 대한 IFM 형태를 보존하는 프로토콜, 기계적 평가를 위한 IFM 섬유 분리31,또는 극저온절38에서 푸팔 IFM의 미세해부를 활용하는 프로토콜은 너무 전문화되고 시간및 오믹스 응용 프로그램에 대한 IFM 조직의 충분한 양을 합리적으로 얻기 위해 노동 집약적. 다른 프로토콜은 특히 성인 IFM38,39의신속한 해부를 위해 개발되었으며, 따라서 pupal 단계에 적용되지 않으며, 이상적이지 않거나 RNA 격리와 호환되지 않을 수 있는 버퍼를 사용한다. 따라서, 생화학 또는 오믹 응용을 위한 pupal IFM을 분리하기 위한 새로운 접근법을 개발할 필요가 있다.
여기서 우리는 16h APF에서 성인 단계16,32를통해 mRNA-Seq 분석을 위해 성공적으로 사용된 pupal 단계 동안 IFM의 해부를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 녹색 형광 단백질 (GFP) 라벨을 사용하여 pupal 및 성인 발달의 모든 단계에서 IFM을 식별하여 형광 해부 현미경하에서 살아있는 해부를 허용합니다. 이 접근 방식은 기존 IFM 해부 프로토콜보다 처리량이 높은 노동 집약적입니다. 이를 통해 시료의 신속한 분리 및 동결 보존이 가능하여, 오믹스 접근법뿐만 아니라 표준 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 서부 블로팅에 대해 여러 차례 해부 후 충분한 물질을 생성할 수 있습니다.
우리는 48 h APF 전(초기 변형 중, IFM 부착이 더 엄격할 때) 및 48시간 APF(푸팔 바디 플랜 및 IFM 부착이 잘 정의된 경우) 모두 IFM을 빠르게 해부하는 방법을 보여주는 두 부분으로 프로토콜을 제시합니다. 우리는 모든 시점에서 해부 된 IFM에서 고품질 RNA를 분리하고 RNA 격리 및 역 전사에 대한 다른 접근법에 대한 데이터를 제시 할 수 있음을 보여줍니다. 마지막으로, CELF1 호몰로그 Bruno1을 예로 사용하여 mRNA-Seq, 질량 분석법 및 RT-PCR에 해부 프로토콜의 적용을 입증한다. 우리는 Bruno1 돌연변이 IFM에서 프로테오믹스 데이터에서 사르코메르 단백질 이소폼의 오발성을 보여주고 Myosin중쇄(Mhc)의C 말단 스플라이스 이벤트의 Bruno1 조절을 조사하였다. 이러한 결과는 omics 데이터가 유전 적 및 생화학 적 실험을 보완하는 생물학적 현상에 대한 깊은 이해를 제공 할 수있는 방법을 보여줍니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 단백질, DNA, RNA 또는 그밖 거대 분자의 하류 격리를 위한 초기와 말기 pupae에서 Drosophila IFMs를 해부하는 기본적인 기술을 제시합니다. 이 프로토콜은 성인 파리에서 IFM을 해부하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. 우리는 mRNA-Seq, 프로테오믹스 및 RT-PCR 애플리케이션에 대한 해부 프로토콜의 유용성을 입증합니다. 시작 재료가 적고 입력 농도가 낮은 샘플을 분석할 수 있는 omics 기술의 지속적인 개선으로 이러한 해부는 많은 추가 응용 분야에서 유용하게 사용될 것입니다. IFM은 인간 근병증에 대한 확립 된 모델이기 때문에4,24 및 근육 유형 특정 개발9,12, 예를 들어 IFM 농축 대사체학, 크로마틴 형태 조사 3C 또는 4C를 통해, CLiP 상호 작용 또는 근위 병의 인광 -프로테오믹스를 통해 네트워크 평가를 접합.
이러한 해부가 순수 IFM 샘플 대신 IFM용 으로 농축된 샘플을 생성한다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 이것은 모터 신경 내심, 힘줄 부착 및 근육 섬유의 기관 침입으로 인해 피할 수 없습니다. 생물정보학 분석은 IFM 농축 유전자 또는 단백질을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다, 그러나 추가 실험은 실제로 IFM 특정하다는 것을 증명하기 위하여 요구됩니다. 샘플 순도는 스트라이프45(힘줄), Act79B4,44(관형 근육), Act88F15(IFM) 또는 syb46(뉴런 특이적)과 같은 출판된 조직 특이적 마커를 사용하여 분석할 수 있다. 이러한 마커를 사용하여 IFM 특이적 콘텐츠로 데이터 세트를 정규화할 수 있지만, 사용자는 정상화를 위해 사용되는 유전자의 발현의 시간적 변화, 예를 들어 IFM 특이적 유전자 또는 튜불린의 경우 이러한 접근법을 편향시킬 수 있다는 경고를 받습니다.
유전자 부호화 조직 특이적 라벨링 방법, 예를 들어 EC-태깅47,48 또는 PABP 라벨링49,50 분리 RNA에 대한 최근 몇 년 동안 개발되었으며, 이는 진정으로 얻을 수 있는 데 도움이 될 수 있다. 조직 특정 RNA 견본. 그러나, EC 태깅은파리(47)의 지속적인 공급을 필요로 하므로 푸팔 단계 에는 적용되지 않는다. PABP 표지된 전사체의 민감도 및 완전성에는51에제한이 있을 수 있다. 개별 근육 섬유를 분리하는 FACS 접근법은 IFMs의 큰 크기와 동기화 특성에 의해 복잡합니다. INTACT52,53 스타일 접근법은 IFM으로부터 특정 세포실 구획을 분리하기 위해 적용될 수 있으며, 이는 IFM 핵 또는 미토콘드리아의 순수한 집단을 분리하는 데 유용할 수 있다. 수동 해부는 대부분의 다운스트림 응용에 대해 그대로 IFM 조직을 얻기 위해 여전히 현재 표준입니다.
시료 품질은 해부 공정의 몇 가지 중요한 단계에 따라 달라집니다. 해부는 기술적으로 까다롭고, 해부 속도와 샘플 순도는 경험에 따라 증가합니다. 세제 없이 냉각된 완충제에서 짧은 시간(20-30분)에 대해 해부하고 즉시 동결하면 마우스 힘줄격리(54)에대해 이전에 관찰된 바와 같이 시료 무결성을 보존하는 데 도움이 된다. IFM은 펠릿에서 모든 버퍼를 제거한 후 성공적으로 건조 동결될 수 있지만, 특히 RNA 격리를 위해, 분리 완충제에서 샘플을 동결하면 더 나은 결과를 얻을 수 있다. 최대 20개의 개별 해부로부터의 IFM은 RNA 또는 단백질 분리 이전에 결합되어 다운스트림 분석을 위해 초기 시점 또는 돌연변이체 16,32에서도충분한 물질을 확장하고 수집할 수 있습니다.
RNA 적용의 경우, 가장 중요한 단계는 RNA 자체의 분리일 수 있다. Guanidinium thiocyanate-페놀-클로로포름 절연(위의 방법 1)은 시험된 대부분의 상용 키트를 능가하며, 앞서 언급한 바와 같이 상당히저렴하다 55. 상용 키트와 RNA 격리 수율에서 관찰된 가변성은 이전관측56,57과일치한다. 우리는 또한 모든 RNA를 복구하는 데 도움이 이소 프로판 올 강수 시 글리코겐을 추가합니다. RNA 수율을 넘어서, RNA 무결성을 확인하여 해부 및 격리 공정 중에 샘플이 단편화되거나 저하되지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다. RNase 가 없는 작업도 필수적입니다. 마지막으로, RT 키트의 선택은 역전사 공정의 감도에 영향을 미칠 수 있다. 자세히 설명하지는 않지만 이러한 모든 점은 IFM 샘플의 품질과 다운스트림 응용 프로그램에서 얻은 데이터에 영향을 미칩니다.
몇 가지 중요한 수정은 기존 IFM 해부 프로토콜과 는 별개로 프로토콜을 설정합니다. IFM 면역형광에 대한 상세한 해부 프로토콜이19개존재하지만, 이 프로토콜은 IFM 조직의 보다 신속한 분리를 허용하는 푸팔 해부에 대한 다른 접근법을 제시한다. 이것은 프로테오메 또는 전사체 변경을 방지하기 위하여 제한된 해부 시간을 가진 IFM 조직 (상대적으로 말하기)의 다량의 집합을 허용합니다. 다른 프로토콜은 개별 myofibrils에서 GFP 염색을 시각화하기 위한 성인 IFM의 해부를기술합니다 39 또는 애벌레 바디 벽 근육의 염색을 위해58,그러나 pupal 단계에서 또는 RNA 또는 단백질의 격리를 위해 해부를 다루지 않습니다. 이 접근법은 또한 더 순수한 IFM 샘플을 생성할 수 있지만 노동 집약적이고 더 적은 물질을 생성하는 저온 절38에서pupal IFM의 미세 해부에 대한 기존 프로토콜과 구별된다. 다른 급속성 IFM 해부 프로토콜38,39,IFM은 스트레스 유도 및 기타 주요 발현 변화를 제한하기 위해 세제 없이 PBS 버퍼로 단리된다.
이 프로토콜의 핵심 은 초기 pupal 단계에서 IFM을 격리 할 수 있도록 라이브 형광 리포터를 포함하는 것입니다. 우리는 표준적으로 Mef2-GAL459 운전 UAS-CD8::GFP 또는 UAS-GFP를 사용합니다::Gma60. 이것은 IFM의 차등 라벨링을 허용합니다 (비행 근육은 다른 pupal 근육보다 더 강하게 표시되고 다르게 모양) 뿐만 아니라 GAL4-UAS 기반 조작의 성능, 예를 들어 구조 또는 RNAi 실험. 또한 Mef2-GAL4를 욕조-GAL80ts와 결합하여 RNAi 관련 조기 치사를 피하거나 UAS-Dcr2와 결합하여 RNAi 효율40을증가시킬 수 있다.
Mef2-GAL4대신 사용할 수 있는 근육 유형 특이성, 시간발현 패턴 및 드라이버 강도19,61에서 변화하는 추가 GAL4 드라이버 또는 GFP 라인이 사용 가능합니다. 예를 들어 Act88F-GAL4는 처음에는 24h APF 를 중심으로 표현되므로 이전 타임포인트에는 사용할 수 없습니다. 그러나, 그것은 강하게 IFM를 표시하고 RNAi 관련 초기 치사성을 피하기 위하여 유용할 지도 모릅니다. 그-GFP 또는 Act88F-GFP라벨 IFM, 다시 시간적 제한으로, 그러나 그들은 마커 발현의 GAL4 의존성을 피하고 관심의 돌연변이 배경과 조합하여 유용할 수 있다. 다른 가능한 마커 라인의 목록은 사용할 수있습니다 19. 또한 유전자 및 GAL4/UAS 시스템의 사용은 유전자 발현 아티팩트를 유발할 수 있으므로, 예를 들어 드라이버 라인이 야생 형 배경 변형으로 교차하여 이러한 아티팩트가 아마도 그러하도록 적절한 컨트롤을 사용하는 것이 중요합니다. 모든 샘플에서 동일합니다.
첨부 된 비디오와 함께,이 상세한 프로토콜은 pupal IFM 해부를 보다 쉽게 접근할 수 있도록하고 근육 발달을 연구하기 위한 오믹스 접근법의 사용을 촉진하는 것을 목표로합니다. 해부된 IFM을 통해 접근할 수 있는 생화학 및 오믹스 분석과 Drosophila 유전학 및 세포 생물학의 힘을 결합하는 것은 myogenesis 및 근육 기능의 기계론적인 이해를 발전시키는 잠재력을 가지고 있습니다. 전사체 및 단백질 조절의 시스템 수준 관찰을 신진 대사 및 기능적 출력과 연결하는 향후 연구는 근육 유형 의 특정 개발 및 근육 장애의 발병 기전에 대한 깊은 이해를 제공할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
안드레아스 라두르너와 프랭크 슈노어에게 감사의 말입니다. 우리는 우수한 기술 지원과 질량 분석 데이터를 생성하기위한 아칸샤 로이 산드라 에세르 에게 감사드립니다. 우리는 블루밍턴과 비엔나 스톡 센터가 파리를 제공한 것을 인정합니다. 우리는 LMU 생물 의학 센터 (Martinsried, DE)에서 질량 분광 샘플의 분석을 위한 공초점 화상 진찰과 Zentrallabor für Proteinanalytik에 도움을 위한 핵심 시설 Bioimaging에 감사드립니다. 우리의 작업은 도이치 포르충스 게마인샤프트 (MLS, SP 1662/3-1), 통합 단백질 과학 뮌헨 센터 (CIPSM) 루드비히 막시밀리안 대학 뮌헨 (MLS), 프레데리히 – 바우어 스티퉁 (MLS), 그리고 국제 맥스에 의해 지원되었다 플랑크 연구 학교 (EN).
5x High Fidelity (HF) buffer | Thermo Fisher | F518L | |
60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
black dissecting dish (glass) | Augusta Laborbedarf | 42021010 | Lymphbecken, black glass, 4×4 cm |
black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder | Sigma-Aldrich | C9157 | Also available from most pharmacies |
black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes). |
blue pestle | Sigma-Aldrich | Z359947-100EA | Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder |
cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
chloroform | PanReac AppliChem | A3691,0500 | |
confocal microscope, Leica SP8X upright confocal | Leica | www.leica-microsystems.com | |
confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal | Zeiss | www.zeiss.com | |
double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip |
EtOH (100%, RNase free) | Sigma-Aldrich | 32205-M | |
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’. |
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
microtome blades | PFM Medical | 207500003 | C35 feather 80mm |
Monarch DNase I | New England Biolabs | T2004-21 | |
Monarch DNase I Reaction Buffer | New England Biolabs | T2005-21 | |
normal goat serum | Thermo Fisher | 16210072 | |
OneTaq Polymerase | New England Biolabs | M0480X | |
Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Fisher | F-530XL | |
Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
Preomics iST 8x Kit | Preomics | P.O.00001 | peptide preparation kit for mass spectrometry |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | 725500 | mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center |
Qubit RNA Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | |
rhodamine-phalloidin | Invitrogen, Molecular Probes | 10063052 | |
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
RNA Pico Chips | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
RNase A | Promega | A7937 | |
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
slide mounting buffer, Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | containing DAPI |
statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |