Sammenligning metastatisk klar celle renal celle karcinom model etableret i mus nyre og på Kylling Chorioallantoic Membran
Summary
Metastatisk klar celle nyrecelle karcinom er en sygdom uden en omfattende dyremodel for grundig præklinisk undersøgelse. Denne protokol illustrerer to nye dyremodeller for sygdommen: den ortotopisk implanterede musemodel og kyllingchorioallantoic membranmodellen, som begge viser lungemetastase, der ligner kliniske tilfælde.
Abstract
Metastatisk klar celle nyrecelle karcinom (ccRCC) er den mest almindelige undertype af nyrekræft. Lokaliseret ccRCC har et gunstigt kirurgisk resultat. Men, en tredjedel af ccRCC patienter vil udvikle metastaser til lungerne, hvilket er relateret til et meget dårligt resultat for patienterne. Desværre er ingen behandling tilgængelig for denne dødbringende fase, fordi den molekylære mekanisme metastase forbliver ukendt. Det har været kendt i 25 år, at tabet af funktion af von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor genet er patognomonic af CCRCC. Der er dog ikke genereret nogen klinisk relevant transgen musemodel af ccRCC. Formålet med denne protokol er at indføre og sammenligne to nyetablerede dyremodeller for metastatisk ccRCC. Den første er nyreimplantation i musemodellen. I vores laboratorium blev CRISPR-genredigeringssystemet udnyttet til at slå VHL-genet ud i flere RCC-cellelinjer. Ortopisk implantation af heterogene ccRCC populationer til nyrekapslen skabt nye ccRCC modeller, der udvikler robuste lunge metastaser i immunkompetente mus. Den anden model er kylling chorioallantoic membran (CAM) system. I forhold til musemodellen er denne model mere tid, arbejdskraft og omkostningseffektiv. Denne model støttede også robust tumordannelse og intravasation. På grund af den korte 10 dages periode med tumorvækst i CAM blev der ikke observeret åbenlys metastase af immunhistokemi (IHC) i det indsamlede embryonvæv. Men, når tumor vækst blev forlænget med to uger i udklækket kylling, mikrometastatisk ccRCC læsioner blev observeret af IHC i lungerne. Disse to nye prækliniske modeller vil være nyttige til yderligere at studere den molekylære mekanisme bag metastase, samt at etablere nye, patient-afledte xenografts (PDXs) mod udvikling af nye behandlinger for metastatisk ccRCC.
Introduction
Renal celle karcinom (RCC) er den 7th mest almindelige kræft i USA. Årligt, 74.000 amerikanere skønnes at være nydiagnosticeret, tegner sig for mere end 14.000 dødsfald (Clear-celle histologisk undertype, eller ccRCC, er den mest almindelige undertype, tegner sig for omkring 80% af RCC tilfælde. Patienter med lokaliseret malignitet behandles med nefrotomi og har en gunstig 5-årig overlevelsesrate på 73%1. Men, 25%-30% af patienterne udvikler fjerne metastaser til vitale organer såsom lungerne, hvilket resulterer i en dårlig gennemsnitlig overlevelse på 13 måneder og 5-årig overlevelsesrate på kun 11%1,2,3. Yderligere forståelse af den metastatiske mekanisme er nødvendig for at forbedre det dødelige resultat for metastatisk ccRCC.
Tabet af VHL tumor suppressor genet er et kendetegn en genetisk læsion observeret i et flertal af humane ccRCC tilfælde4,5,6,7. Den præcise onkogene mekanisme for VHL-tab i CCRCC er imidlertid ukendt. Også, VHL udtryk status er ikke forudsigende for resultatet i CCRCC8. Især, på trods af talrige forsøg på renal-epitel-målrettet VHL knockout, forskere har undladt at generere nyreabnormitet ud over de præneoplastiske cystisk læsioner observeret i mus9, selv når det kombineres med sletning af andre tumor suppressors såsom PTEN og p5310. Disse resultater understøtter tanken om, at VHL tab alene er utilstrækkelig til tumorigenese eller den efterfølgende spontane metastase.
For nylig har vores laboratorium skabt en ny VHL knockout (VHL-KO) cellelinje ved hjælp af CRISPR/Cas9 medieret sletning af VHL genet i murine VHL + ccRCC cellelinje (RENCA, eller VHL-WT)11,12. Vi viste, at VHL-KO ikke kun er mesenkymale, men også fremmer tilnavn i forbindelse med mesenkymale overgang (EMT) af VHL-WT celler12. EMT er kendt for at spille en vigtig rolle i den metastatiske proces13. Vores arbejde viste yderligere, at fjerne lungemetastase kun forekommer med co-implantation af VHL-KO og VHL-WT celler i nyrerne, støtte en kooperativ mekanisme af metastase. Det er vigtigt, at vores ortotopisk implanterede VHL-KO og VHL-WT-modellen fører til robuste lungemetastaser, hvilket opsummerer de kliniske ccRCC-tilfælde. Denne spontane metastatiske ccRCC model kompenserer for manglen på en transgen metastatisk musemodel, især i udviklingen af nye anti-metastase lægemidler. Denne protokol viser renal kapsel implantation af de heterogene cellepopulationer af genetisk manipuleret RENCA celler.
Kylling CAM modeller har en lang historie i forskning for angiogenese og tumor biologi på grund af deres mange fordele, som opsummeret i tabel 114,15,16,17,18. Kort, tidsvinduet for CAM tumor vækst er kort, så højst 11 dage, indtil CAM er ødelagt ved udklækning afkyllingen 16. På trods af den korte væksttid muliggør kyllingefosterets rige ernæringsforsyning og immundefekttilstand meget effektiv tumorengraftment16,19,20,21. Endelig er omkostningerne ved hvert befrugtet æg ~ $ 1, sammenlignet med over $ 100 for en SCID mus. Sammen kan CAM-modellen fungere som en værdifuld alternativ dyremodel i etableringen af nye PDX’er til en stor besparelse i tid og omkostninger i forhold til musen. I denne protokol vurderede vi, om modellen var i stand til at opsummere biologien af metastatisk ccRCC observeret i musen ortotopmodel.
| (SCID) Musen | Cam | Bemærk | |
| Omkostninger | >$100 hver | ~$1 hver | Levedygtighed fra 50-75% |
| Behov for barriereboliger | Ja | Nej | Yderligere reducerer omkostninger & forenkler seriel overvågning af tumorer |
| Tumor direkte synlig | Nej | Ja | Figur 3A |
| Tid til første indskrivning (RENCA) | 2 uger | 2-4 dage | ref 14, 15 |
| Vækstens slutpunkt (RENCA) | 3-6 uger | 10 dage | ref 14, 15 |
| Metastase (RENCA) observeret | Ja | Ja i kyllinger | Figur 3D |
| Serielle passager | Ja | Ja | ref 16-18 |
| Passage til mus (RENCA) | Ja | Ja | Hu, J., et al. under revision (2019) |
| Opretholde tumor heterogenitet | Ja | Ja | Hu, J., et al. under revision (2019) |
Tabel 1: Fordele og begrænsninger af muse- og CAM-modellerne. Denne tabel sammenligner de to modeller for deres fordele og begrænsninger i form af krævede tid, omkostninger, arbejdskraft, samt biologi. CAM-modellen har fordele i effektivitet, men den har også sine egne unikke begrænsninger på grund af de forskellige morfologier mellem fugle og pattedyr. Derfor er det vigtigt at bekræfte, at modellen kan bevare xenografts’ biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
For mange patienter med epitelmaligniteter er metastase til vitale organer den primære årsag til dødelighed. Derfor er det vigtigt at finde den underliggende mekanisme og en ny mulighed for behandling for metastatisk sygdom. Desværre er der mangel på relevante metastatiske ccRCC dyremodeller. Udfordringen skyldes for en stor del den manglende evne til at genskabe ccRCC i mus på trods af dannelsen af talrige transgene nyre epitel-målrettede VHL knockout musemodeller9,<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af UCLA JCCC frø tilskud, UCLA 3R tilskud, UCLA CTSI, og UC TRDRP (LW). Vi takker Crump Institute’s Preclinical Imaging Facility, TPCL, og UCLA’s Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) for deres hjælp med eksperimentelle metoder. Flow cytometri blev udført i UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) og Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility, der støttes af National Institutes of Health awards P30 CA016042 og 5P30 AI028697, og af JCCC, UCLA AIDS Institute, David Geffen School of Medicine på UCLA, UCLA kanslerkontor, og UCLA Vice Chancellor’s Office of Research. Statistik rådgivning og dataanalyse tjenester blev leveret af UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiologi, og Research Design (BERD) Program, der støttes af NIH / National Center for Fremme Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. . Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, (1971).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2019).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. . Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
