Vergelijking van uitgezaaide Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model opgericht in muisnier en op Kip Chorioallantoic Membraan
Summary
Uitgezaaid helder celnieraal celcarcinomis is een ziekte zonder een uitgebreid diermodel voor grondig preklinisch onderzoek. Dit protocol illustreert twee nieuwe diermodellen voor de ziekte: het orthotopicalisch geïmplanteerde muismodel en het kipchorioallantoïsche membraanmodel, die beide longmetastasen aantonen die lijken op klinische gevallen.
Abstract
Uitgezaaide heldere cel niercel carcinoma (ccRCC) is de meest voorkomende subtype van nierkanker. Gelokaliseerde ccRCC heeft een gunstige chirurgische uitkomst. Echter, een derde van ccRCC patiënten zal ontwikkelen metastasen naar de long, die gerelateerd is aan een zeer slechte uitkomst voor patiënten. Helaas is er geen therapie beschikbaar voor deze dodelijke fase, omdat het moleculaire mechanisme van metastase onbekend blijft. Het is al 25 jaar bekend dat het verlies van functie van de von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gen pathognomonic van ccRCC is. Er is echter geen klinisch relevant transgene muismodel van ccRCC gegenereerd. Het doel van dit protocol is het introduceren en vergelijken van twee nieuw opgerichte diermodellen voor gemetastaseerde ccRCC. De eerste is nierimplantatie in het muismodel. In ons laboratorium werd het CRISPR-genbewerkingssysteem gebruikt om het VHL-gen in verschillende RCC-cellijnen uit te schakelen. Orthotopische implantatie van heterogene ccRCC populaties naar de niercapsule creëerde nieuwe ccRCC-modellen die robuuste longmetastasen ontwikkelen bij immunocompetente muizen. Het tweede model is het kipchorioallantoïsche membraan (CAM) systeem. In vergelijking met het muismodel is dit model meer tijd, arbeid en kostenefficiënt. Dit model ondersteunde ook robuuste tumorvorming en intravasatie. Vanwege de korte periode van 10 dagen van tumorgroei in CAM, werd geen openlijke metastase waargenomen door immunohistochemie (IHC) in de verzamelde embryoweefsels. Echter, toen de tumorgroei werd uitgebreid met twee weken in de uitgebroede kip, werden microgemetastase ccRCC laesies waargenomen door IHC in de longen. Deze twee nieuwe preklinische modellen zullen nuttig zijn om het moleculaire mechanisme achter metastase verder te bestuderen en om nieuwe, door patiënten afgeleide xenografts (PDX’s) vast te stellen voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor gemetastaseerde ccRCC.
Introduction
Niercelcarcinoma (RCC) is de7e meest voorkomende kanker in de Verenigde Staten. Jaarlijks, 74.000 Amerikanen worden geschat op nieuw gediagnosticeerd, goed voor meer dan 14.000 sterfgevallen (Clear-cell histologische subtype, of ccRCC, is de meest voorkomende subtype, goed voor ongeveer 80% van de RCC gevallen. Patiënten met gelokaliseerde maligniteit worden behandeld met nefrectomie en hebben een gunstige 5-jaars overlevingskans van 73%1. Echter, 25%-30% van de patiënten ontwikkelen verre metastasen naar vitale organen zoals de longen, wat resulteert in een slechte gemiddelde overleving van 13 maanden en 5-jaars overlevingskans van slechts 11%1,2,3. Verder begrip van het uitgezaaide mechanisme is nodig om de dodelijke uitkomst voor gemetastaseerde ccRCC te verbeteren.
Het verlies van het VHL tumorsuppressorgen is een kenmerk genetische laesie waargenomen in een meerderheid van de menselijke ccRCC gevallen4,5,6,7. Het precieze oncogene mechanisme van VHL-verlies in ccRCC is echter onbekend. Ook is de VHL-expressiestatus niet voorspellend voor de uitkomst in ccRCC8. Met name, ondanks talrijke pogingen tot nier-epitheliale gerichte VHL knock-out, wetenschappers hebben nagelaten om nierafwijkingen te genereren dan de preneoplastische cystische laesies waargenomen in muizen9, zelfs in combinatie met het verwijderen van andere tumorsuppressors zoals PTEN en p5310. Deze bevindingen ondersteunen het idee dat VHL verlies alleen onvoldoende is voor tumorigenese of de daaropvolgende spontane metastase.
Onlangs heeft ons laboratorium een nieuwe VHL knock-out (VHL-KO) cellijn met behulp van CRISPR / Cas9 gemedeerde schrapping van het VHL-gen in de murine VHL + ccRCC cellijn (RENCA, of VHL-WT)11,12. We toonden aan dat VHL-KO niet alleen mesenchymale is, maar ook epitheel bevordert tot mesenchymale overgang (EMT) van VHL-WT cellen12. Het is bekend dat EMT een belangrijke rol speelt in het uitgezaaide proces13. Ons werk toonde verder aan dat verre longmetastase alleen optreedt met co-implantatie van VHL-KO- en VHL-WT-cellen in de nier, ter ondersteuning van een coöperatief mechanisme van metastase. Belangrijk is dat ons orthotopically geïmplanteerde VHL-KO- en VHL-WT-model leidt tot robuuste longmetastasen, die de klinische ccRCC-gevallen samenvatten. Dit spontane gemetastaseerde ccRCC-model compenseert het ontbreken van een transgeen gemetastaseerd muismodel, vooral bij de ontwikkeling van nieuwe antimetastasegeneesmiddelen. Dit protocol toont de niercapsule implantatie van de heterogene celpopulaties van genetisch gemanipuleerde RENCA-cellen.
Chicken CAM modellen hebben een lange geschiedenis in onderzoek naar angiogenese en tumorbiologie als gevolg van hun talrijke voordelen, zoals samengevat in tabel 114,15,16,17,18. Kortom, het tijdvenster voor CAM tumor groei is kort, waardoor een maximum van 11 dagen totdat de CAM wordt vernietigd bij het uitkomen van de kip16. Ondanks de korte groeitijd maken de rijke voeding en de immunodeficiëntie van het kippenembryo een zeer efficiënte tumorengraftment16,19,20,21mogelijk . Ten slotte, de kosten van elke bevruchte eicel is ~ $ 1, vergeleken met meer dan $ 100 voor een SCID muis. Samen kan het CAM-model dienen als een waardevol alternatief diermodel bij het opzetten van nieuwe PDX’s tegen een grote besparing in tijd en kosten in vergelijking met de muis. In dit protocol hebben we beoordeeld of het model in staat was om de biologie van gemetastaseerde ccRCC in het orthotopopisch model van de muis samen te vatten.
| (SCID) Muis | Cam | Opmerking | |
| Kosten | >$100 per stuk | ~$1 per stuk | Levensvatbaarheid variërend van 50-75% |
| Behoefte aan barrièrehuisvesting | Ja | № | Verder vermindert de kosten en vereenvoudigt de seriële monitoring van de tumoren |
| Tumor direct zichtbaar | № | Ja | Figuur 3A |
| Tijd tot eerste engraftment (RENCA) | 2 weken | 2-4 dagen | ref 14, 15 |
| Eindpunt van de groei (RENCA) | 3-6 weken | 10 dagen | ref 14, 15 |
| Metastase (RENCA) waargenomen | Ja | Ja bij kuikens | Figuur 3D |
| Seriële passages | Ja | Ja | ref 16-18 |
| Passage naar muizen (RENCA) | Ja | Ja | Hu, J., et al. onder de loep (2019) |
| Behoud tumorheterogeniteit | Ja | Ja | Hu, J., et al. onder de loep (2019) |
Tabel 1: Voordelen en beperkingen van de muis- en CAM-modellen. Deze tabel vergelijkt de twee modellen voor hun voordelen en beperkingen in termen van vereiste tijd, kosten, arbeid, evenals de biologie. Het CAM-model heeft voordelen in efficiëntie, maar heeft ook zijn eigen unieke beperkingen vanwege de verschillende morfologie tussen vogels en zoogdieren. Daarom is het belangrijk om te bevestigen dat het model de biologie van de xenografts kan behouden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor veel patiënten met epitheliale maligniteiten is metastase naar vitale organen de belangrijkste oorzaak van sterfte. Daarom is het essentieel om het onderliggende mechanisme en een nieuwe manier van therapie voor gemetastaseerde ziekte te vinden. Helaas is er een gebrek aan relevante gemetastaseerde ccRCC diermodellen. De uitdaging is voor een groot deel te wijten aan het onvermogen om ccRCC opnieuw in muizen, ondanks de generatie van tal van transgene nier epithelial-gerichte VHL knock-out muis modellen<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de UCLA JCCC seed grant, UCLA 3R grant, UCLA CTSI en UC TRDRP (LW). Wij danken de Preklinische Beeldvormingsfaciliteit van het Crump Institute, de TPCL en het Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) van het Crump Institute voor hun hulp bij experimentele methoden. Flow cytometrie werd uitgevoerd in de UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) en Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility, die wordt ondersteund door National Institutes of Health awards P30 CA016042 en 5P30 AI028697, en door de JCCC, de UCLA AIDS Institute, de David Geffen School of Medicine aan de UCLA, de UCLA Chancellor’s Office, en de UCLA Vice Chancellor’s Office of Research. Statistieken consulting en data-analyse diensten werden geleverd door de UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiologie, en Research Design (BERD) Programma dat wordt ondersteund door NIH / National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. . Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, (1971).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2019).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. . Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
