माउस किडनी में स्थापित मेटास्टैटिक क्लियर सेल रेनल सेल कार्सिनोमा मॉडल की तुलना और चिकन कोरियोलंटोइक झिल्ली पर
Summary
मेटास्टैटिक क्लियर सेल रीनल सेल कार्सिनोमा पूरी तरह से प्रीक्लीनिकल जांच के लिए एक व्यापक पशु मॉडल के बिना एक बीमारी है। यह प्रोटोकॉल रोग के लिए दो उपन्यास पशु मॉडल दिखाता है: ऑर्थोटोपिक रूप से प्रत्यारोपित माउस मॉडल और चिकन कोरियोलेंटोइक झिल्ली मॉडल, दोनों नैदानिक मामलों जैसी फेफड़ों के मेटास्टेसिस का प्रदर्शन करते हैं।
Abstract
मेटास्टैटिक क्लियर सेल रेनल सेल कार्सिनोमा (सीसीआरसीसी) किडनी कैंसर का सबसे आम सबटाइप है। स्थानीयकृत सीसीआरसीसी का अनुकूल शल्य चिकित्सा परिणाम है। हालांकि, सीसीआरसीसी के एक तिहाई मरीज फेफड़ों के मेटाटैस विकसित करेंगे, जो मरीजों के लिए बहुत खराब परिणाम से संबंधित है । दुर्भाग्य से, इस घातक चरण के लिए कोई चिकित्सा उपलब्ध नहीं है, क्योंकि मेटाटैसिस का आणविक तंत्र अज्ञात रहता है। यह 25 साल से जाना जाता रहा है कि वॉन हिपपेल-लिंडाऊ (वीएचएल) ट्यूमर दमनकारी जीन के फंक्शन का नुकसान सीसीआरसीसी का रोगोग्नि है । हालांकि, सीसीआरसीसी का कोई चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल उत्पन्न नहीं किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मेटास्टैटिक सीसीआरसीसी के लिए दो नए स्थापित पशु मॉडलों को पेश करना और तुलना करना है। माउस मॉडल में पहला गुर्दे प्रत्यारोपण है। हमारी प्रयोगशाला में, CRISPR जीन संपादन प्रणाली का उपयोग कई आरसीसी सेल लाइनों में वीएचएल जीन को खटखटाने के लिए किया गया था। गुर्दे कैप्सूल के लिए विषम सीसीआरसी आबादी के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण ने उपन्यास सीसीआरसीसी मॉडल बनाए जो इम्यूनोसक्षम चूहों में मजबूत फेफड़ों के मेटास्टेस विकसित करते हैं। दूसरा मॉडल चिकन कोरियोएलनोइक झिल्ली (कैम) सिस्टम है। माउस मॉडल की तुलना में, यह मॉडल अधिक समय, श्रम और लागत-कुशल है। इस मॉडल ने मजबूत ट्यूमर गठन और इंट्राविटेशन का भी समर्थन किया। कैम में ट्यूमर के विकास की कम 10 दिन की अवधि के कारण, एकत्र भ्रूण ऊतकों में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा कोई भी अनाप-शनाप मेटास्टेमिस नहीं देखा गया । हालांकि, जब ट्यूमर के विकास को रची चिकन में दो सप्ताह तक बढ़ाया गया था, माइक्रोमेटास्टैटिक सीसीआरसीसी घावों को आईएचसी द्वारा फेफड़ों में देखा गया था। ये दो उपन्यास प्रीक्लिनिकल मॉडल मेटास्टैटिक सीसीआरसीसी के लिए उपन्यास उपचार के विकास की ओर नए, रोगी-व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) स्थापित करने के लिए मेटास्टेटिक सीसीआरसीसी के पीछे आणविक तंत्र का अध्ययन करने के साथ-साथ उपयोगी होंगे।
Introduction
गुर्दे सेल कार्सिनोमा (आरसीसी) संयुक्त राज्य अमेरिका में 7सबसे आम कैंसर है। सालाना, ७४,००० अमेरिकियों को नए निदान होने का अनुमान है, १४,००० से अधिक मौतों के लिए लेखांकन (स्पष्ट सेल हिस्टोलॉजिकल उपप्रकार, या सीसीआरसी, सबसे आम उपप्रकार है, आरसीसी मामलों के लगभग ८०% के लिए लेखांकन । स्थानीयकृत द्रोह वाले रोगियों का इलाज नेफ्रोक्टॉमी से किया जाता है और 73% 1 की अनुकूल 5 साल की जीवित रहने की दरहोतीहै। हालांकि, 25%-30% रोगी फेफड़ों जैसे महत्वपूर्ण अंगों के लिए दूर मेटास्टेटेस विकसित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप 13 महीने का खराब मतलब जीवित होता है और केवल 11%1,2,3की 5 साल की जीवित रहने की दर होती है। मेटास्टैटिक सीसीआरसीसी के लिए घातक परिणाम में सुधार करने के लिए मेटास्टैटिक तंत्र की और समझ की आवश्यकता है।
वीएचएल ट्यूमर दबाने वाले जीन का नुकसान मानव सीसीआरसीसी के अधिकांश मामलों4,5,6,7में एक बानगी आनुवंशिक घाव है . हालांकि, सीसीआरसीसी में वीएचएल हानि का सटीक ऑनकोजेनिक तंत्र अज्ञात है। इसके अलावा, वीएचएल अभिव्यक्ति की स्थिति सीसीआरसीसी8में परिणाम की भविष्य कहनेवाला नहीं है । विशेष रूप से, गुर्दे-एपिथेलियल-लक्षित वीएचएल नॉकआउट में कई प्रयासों के बावजूद, वैज्ञानिक9चूहों में देखे गए प्रीनियोप्लास्टिक सिस्टिक घावों से परे गुर्दे की असामान्यता उत्पन्न करने में विफल रहे हैं, यहां तक कि जब PTEN और p5310जैसे अन्य ट्यूमर दबाने वालों को हटाने के साथ संयुक्त किया गया है। ये निष्कर्ष इस विचार का समर्थन करते हैं कि अकेले वीएचएल हानि ट्यूमरिजनया बाद के सहज मेटास्टासिस के लिए अपर्याप्त है।
हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला ने एक नई वीएचएल नॉकआउट (VHL-KO) सेल लाइन बनाई, जिसमें मुरीन वीएचएल + सीसीआरसीसी सेल लाइन (RENCA, या VHL-WT)11,12में वीएचएल जीन के CRISPR/Cas9 मध्यस्थता हटाने का उपयोग किया गया । हमने दिखाया कि वीएचएल-को न केवल मेसेनचिमल है, बल्कि वीएचएल-डब्ल्यूटी कोशिकाओं12के मेसेंचिमल संक्रमण (ईएमटी) के लिए विशेषण को भी बढ़ावा देता है। ईएमटी को मेटास्टैटिक प्रक्रिया13में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है । हमारे काम से आगे पता चला है कि दूर फेफड़ों मेटास्टासिस केवल सह के साथ होता है VHL-KO और VHL-WT कोशिकाओं के गुर्दे में प्रत्यारोपण, मेटास्टासिस के एक सहकारी तंत्र का समर्थन । महत्वपूर्ण बात, हमारे ऑर्थोटोपरिक रूप से प्रत्यारोपित वीएचएल-KO और वीएचएल-डब्ल्यूटी मॉडल मजबूत फेफड़ों के मेटास्टेज़ की ओर जाता है, जो नैदानिक सीसीआरसीसी मामलों को फिर से तैयार करता है। यह सहज मेटास्टैटिक सीसीआरसीसी मॉडल ट्रांसजेनिक मेटास्टैटिक माउस मॉडल की कमी की भरपाई करता है, खासकर उपन्यास एंटी-मेटास्टैसिस दवाओं के विकास में। यह प्रोटोकॉल आनुवंशिक इंजीनियर RENCA कोशिकाओं की विषम कोशिका आबादी के गुर्दे कैप्सूल प्रत्यारोपण को दर्शाता है ।
चिकन कैम मॉडल ों का उनके कई फायदों के कारण एंजियोजेनेसिस और ट्यूमर बायोलॉजी के लिए शोध में एक लंबा इतिहास रहा है, जैसा कि तालिका14,15,16,17,18में संक्षेप में किया गया है। संक्षेप में, कैम ट्यूमर के विकास के लिए समय खिड़की कम है, जब तक कैम चिकन16के हैचिंग पर नष्ट हो जाता है 11 दिनों की एक अधिकतम अनुमति । कम विकास के समय के बावजूद, चिकन भ्रूण की समृद्ध पोषण आपूर्ति और इम्यूनोडिफिजेंट स्थिति बहुत कुशल ट्यूमर एनग्राफमेंट16,19,20,21को सक्षम करती है। अंत में, प्रत्येक निषेचित अंडे की लागत ~ $ 1 है, एक SCID माउस के लिए $ 100 से अधिक की तुलना में। साथ में, कैम मॉडल माउस की तुलना में समय और लागत में एक महान बचत पर नए PDXs की स्थापना में एक मूल्यवान वैकल्पिक पशु मॉडल के रूप में काम कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने आकलन किया कि क्या मॉडल माउस ऑर्थोटोपिक मॉडल में मनाए गए मेटास्टैटिक सीसीआरसीसी के जीव विज्ञान को फिर से तैयार करने में सक्षम था।
| (एससीआईडी) माउस | कैम | नोट | |
| लागत | 100 डॉलर प्रत्येक | ~ $ 1 प्रत्येक | 50-75% से लेकर व्यवहार्यता |
| बैरियर आवास की आवश्यकता | हाँ | नहीं | इसके अलावा लागत कम कर देता है और ट्यूमर की धारावाहिक निगरानी को सरल बनाता है |
| ट्यूमर सीधे दिखाई दे रहा है | नहीं | हाँ | चित्रा 3A |
| पहले engraftment (RENCA) के लिए समय | 2 सप्ताह | 2-4 दिन | रेफरी 14, 15 |
| विकास का अंतिम बिंदु (RENCA) | 3-6 सप्ताह | 10 दिन | रेफरी 14, 15 |
| मेटास्तासिस (RENCA) मनाया | हाँ | लड़कियों में हां | चित्रा 3D |
| सीरियल पैसेज | हाँ | हाँ | रेफरी 16-18 |
| चूहों के लिए मार्ग (RENCA) | हाँ | हाँ | हू, जे, एट अल समीक्षा के तहत (२०१९) |
| ट्यूमर विषमता बनाए रखें | हाँ | हाँ | हू, जे, एट अल समीक्षा के तहत (२०१९) |
तालिका 1: माउस और कैम मॉडल के फायदे और सीमाएं। यह तालिका आवश्यक समय, लागत, श्रम के साथ-साथ जीव विज्ञान के संदर्भ में उनके फायदे और सीमाओं के लिए दो मॉडलों की तुलना करती है। सीएएम मॉडल दक्षता में फायदे हैं, लेकिन पक्षियों और स्तनधारियों के बीच विभिन्न आकृति विज्ञान के कारण इसकी अपनी अनूठी सीमाएं भी हैं। इसलिए इस बात की पुष्टि करना जरूरी है कि मॉडल जेनोग्राफ्स के बायोलॉजी को बरकरार रख सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एपिथेलियल घातक के साथ कई रोगियों के लिए, महत्वपूर्ण अंगों के लिए मेटास्तासिस मृत्यु का प्राथमिक कारण है । इसलिए, अंतर्निहित तंत्र और मेटास्टैटिक रोग के लिए चिकित्सा का एक नया एवेन्यू खोजना आवश्यक है। …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को यूसीएलए जेसीसीसी सीड ग्रांट, यूसीएलए 3आर ग्रांट, यूसीएलए सीटीएसआई और यूसी टीआरडीआरपी (एलडब्ल्यू) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । हम प्रायोगिक तरीकों के साथ उनकी मदद के लिए क्रूम्प इंस्टीट्यूट की प्रीक्लीनिकल इमेजिंग फैसिलिटी, टीपीसीएल और यूसीएलए के डिपार्टमेंट ऑफ लेबोरेटरी एनिमल मेडिसिन (डीएमएएम) को धन्यवाद देते हैं । फ्लो साइटोमेट्री UCLA जॉनसन कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर (JCCC) और एड्स अनुसंधान प्रवाह साइटोमेट्री कोर सुविधा है कि स्वास्थ्य पुरस्कार P30 CA016042 और 5P30 AI028697 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है के लिए केंद्र में प्रदर्शन किया गया था, और JCCC, UCLA एड्स संस्थान, UCLA में डेविड Geffen स्कूल ऑफ मेडिसिन, UCLA चांसलर कार्यालय, और UCLA कुलपति सांख्यिकी परामर्श और डेटा विश्लेषण सेवाएं UCLA CTSI बायोस्टैटिस्टिक्स, महामारी विज्ञान, और अनुसंधान डिजाइन (BERD) कार्यक्रम है कि NIH द्वारा समर्थित है द्वारा प्रदान की गई/
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
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