Sammenligne metastatisk klar celle nyrecelle karsinom modell etablert i mus nyre og på kylling chorioallantoic membran
Summary
Metastatisk klart celle nyrecellekarsinom er en sykdom uten en omfattende dyremodell for grundig preklinisk undersøkelse. Denne protokollen illustrerer to nye dyremodeller for sykdommen: den ortotopisk implanterte musemodellen og kyllingkorioallantoisk membranmodell, som begge viser lungemetastase som ligner kliniske tilfeller.
Abstract
Metastatisk klart celle nyrecellekarsinom (ccRCC) er den vanligste undertypen av nyrekreft. Lokalisert ccRCC har et gunstig kirurgisk utfall. En tredjedel av ccRCC-pasientene vil imidlertid utvikle metastaser til lungene, noe som er relatert til et svært dårlig resultat for pasientene. Dessverre er ingen terapi tilgjengelig for dette dødelige stadiet, fordi den molekylære mekanismen for metastase forblir ukjent. Det har vært kjent i 25 år at tap av funksjon av von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor genet er patogene av ccRCC. Imidlertid har ingen klinisk relevant transgen musmodell av ccRCC blitt generert. Formålet med denne protokollen er å introdusere og sammenligne to nyetablerte dyremodeller for metastatisk ccRCC. Den første er nyreimplantasjon i musemodellen. I vårt laboratorium ble CRISPR genredigeringssystem benyttet til å slå ut VHL-genet i flere RCC-cellelinjer. Ortotopisk implantasjon av heterogene ccRCC populasjoner til nyrekapselen skapte nye ccRCC-modeller som utvikler robuste lungemetastaser hos immunkompetente mus. Den andre modellen er kylling korioallantoisk membran (CAM) system. I forhold til musemodellen er denne modellen mer tid, arbeidskraft og kostnadseffektiv. Denne modellen støttet også robust tumordannelse og intravasation. På grunn av den korte 10 dagers perioden med tumorvekst i CAM ble ingen overt metastase observert ved immunhistokjemi (IHC) i det innsamlede embryovevet. Men når tumorveksten ble utvidet med to uker i den klekkede kyllingen, ble mikrometastatiske ccRCC-lesjoner observert av IHC i lungene. Disse to nye prekliniske modellene vil være nyttige for å studere den molekylære mekanismen bak metastase, samt å etablere nye, pasientavledede xenografts (PDXs) mot utviklingen av nye behandlinger for metastatisk ccRCC.
Introduction
Nyrecellekarsinom (RCC) er den7. Årlig er 74.000 amerikanere anslått å være nylig diagnostisert, og står for mer enn 14.000 dødsfall (Clear-cell histologisk undertype, eller ccRCC, er den vanligste undertypen, som står for ca 80% av RCC tilfeller. Pasienter med lokalisert malignitet behandles med nephrectomy og har en gunstig 5-års overlevelsesrate på 73%1. Imidlertid utvikler 25% -30% av pasientene fjerne metastaser til vitale organer som lungene, noe som resulterer i en dårlig gjennomsnittlig overlevelse på 13 måneder og 5-års overlevelse på bare 11%1,2,3. Ytterligere forståelse av den metastatiske mekanismen er nødvendig for å forbedre det dødelige utfallet for metastatisk ccRCC.
Tapet av VHL tumor suppressor genet er et kjennetegn genetisk lesjon observert i et flertall av menneskelige ccRCC tilfeller4,5,6,7. Den nøyaktige onkogene mekanismen for VHL-tap i ccRCC er imidlertid ukjent. VHL-uttrykksstatusen er heller ikke prediktiv for utfallet i ccRCC8. Spesielt, til tross for mange forsøk på nyreepitelrettet VHL knockout, har forskere ikke klart å generere nyreabnormitet utover preneoplastiske cystiske lesjoner observert hos mus9, selv når de kombineres med sletting av andre tumorsuppressorer som PTEN og p5310. Disse funnene støtter ideen om at VHL-tap alene er utilstrekkelig for tumorigenese eller den påfølgende spontane metastase.
Nylig opprettet laboratoriet vårt en ny VHL knockout (VHL-KO) cellelinje ved hjelp av CRISPR/Cas9 mediert sletting av VHL-genet i murine VHL+ ccRCC-cellelinjen (RENCA, eller VHL-WT)11,12. Vi viste at VHL-KO er ikke bare mesenchymal, men fremmer også epitel til mesenchymal overgang (EMT) av VHL-WT celler12. EMT er kjent for å spille en viktig rolle i den metastatiske prosessen13. Vårt arbeid viste videre at fjern lungemetastase bare oppstår med samtidig implantasjon av VHL-KO- og VHL-WT-celler i nyrene, som støtter en samarbeidsmekanisme for metastase. Viktigere, vår ortotopically implantert VHL-KO og VHL-WT modell fører til robuste lungemetastaser, rekapitulere kliniskccRCC tilfeller. Denne spontane metastatiske ccRCC-modellen kompenserer for mangelen på en transgen metastatisk musemodell, spesielt i utviklingen av nye antimetastaser. Denne protokollen demonstrerer renal kapsel implantasjon av heterogene cellepopulasjoner av genetisk konstruerte RENCA-celler.
Kylling CAM modeller har en lang historie i forskning for angiogenese og tumorbiologi på grunn av deres mange fordeler, som oppsummert i tabell 114,15,16,17,18. Kort tidsvinduet for CAM tumorvekst er kort, slik at maksimalt 11 dager til CAM er ødelagt ved klekking av kylling16. Til tross for den korte veksttiden, gjør den rike ernæringsforsyningen og immundeficient tilstanden til kyllingembryoet svært effektiv tumorengraftment16,19,20,21. Til slutt, kostnaden for hvert befruktet egg er ~ $ 1, sammenlignet med over $ 100 for en SCID mus. Sammen kan CAM-modellen tjene som en verdifull alternativ dyremodell i å etablere nye PDXs til en god besparelse i tid og kostnadi forhold til musen. I denne protokollen vurderte vi om modellen var i stand til å rekapitulere biologien til metastatisk ccRCC observert i musen ortotopisk modell.
| -Jeg har ikke noe å si. Mus | Cam | Merk | |
| Kostnad | >$100 hver | ~$1 hver | Levedyktighet fra 50-75% |
| Behov for barriereboliger | ja | nei | Ytterligere reduserer kostnader og forenkler serieovervåking av svulstene |
| Tumor direkte synlig | nei | ja | Figur 3A |
| Tid til første engraftment (RENCA) | 2 uker | 2-4 dager | Ref 14, 15 |
| Endepunktet for vekst (RENCA) | 3-6 uker | 10 dager | Ref 14, 15 |
| Metastase (RENCA) observert | ja | Ja i jenter | Figur 3D |
| Serieavsnitt | ja | ja | ref 16-18 |
| Passasje til mus (RENCA) | ja | ja | Hu, J., et al. under gjennomgang (2019) |
| Opprettholde tumorheterogenitet | ja | ja | Hu, J., et al. under gjennomgang (2019) |
Tabell 1: Fordeler og begrensninger i musen og CAM-modellene. Denne tabellen sammenligner de to modellene for sine fordeler og begrensninger når det gjelder nødvendig tid, kostnad, arbeidskraft, samt biologi. CAM-modellen har fordeler i effektivitet, men den har også sine egne unike begrensninger på grunn av den forskjellige morfologien mellom fugler og pattedyr. Derfor er det viktig å bekrefte at modellen kan beholde biologien til xenografts.
Protocol
Representative Results
Discussion
For mange pasienter med epitelmaligniteter er metastase til vitale organer den primære årsaken til dødelighet. Derfor er det viktig å finne den underliggende mekanismen og en ny behandlingsvei for metastatisk sykdom. Dessverre er det mangel på relevante metastatiske ccRCC dyremodeller. Utfordringen i stor grad skyldes manglende evne til å gjenskape ccRCC hos mus til tross for generering av mange transgene nyreepitelmålrettede VHL knockout musemodeller9,10….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av UCLA JCCC frø tilskudd, UCLA 3R stipend, UCLA CTSI, og UC TRDRP (LW). Vi takker Crump Institute’s Preclinical Imaging Facility, TPCL og UCLAs Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) for deres hjelp med eksperimentelle metoder. Flow cytometri ble utført i UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) og Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility som støttes av National Institutes of Health awards P30 CA016042 og 5P30 AI028697, og av JCCC, UCLA AIDS Institute, David Geffen School of Medicine ved UCLA, UCLA Chancellor’s Office, og UCLA Vice Chancellor’s Office of Research. Statistikk rådgivning og dataanalyse tjenester ble levert av UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiology, og Research Design (BERD) Program som støttes av NIH / National Center for Fremme Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. . Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, (1971).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2019).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. . Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
