Сравнение метастатической ясной клеточной почечной карциномы модели, созданной в мышиной почки и на куриные хориоаллантоический Membrane
Summary
Метастатическая ясная клеточная карцинома является заболеванием без комплексной модели животных для тщательного доклинического исследования. Этот протокол иллюстрирует две новые модели животных для болезни: ортотопически имплантированной мыши модели и курица хориоаллантоической мембранной модели, оба из которых демонстрируют метастазирование легких, напоминающие клинические случаи.
Abstract
Метастатическая ясная клеточная карцинома (ccRCC) является наиболее распространенным подтипом рака почек. Локализованный ccRCC имеет благоприятный хирургический исход. Тем не менее, одна треть пациентов CCRCC будет развиваться метастаза в легких, что связано с очень плохим исходом для пациентов. К сожалению, для этой смертельной стадии не предусмотрена терапия, так как молекулярный механизм метастазиса остается неизвестным. Уже 25 лет известно, что потеря функции гена супрессора опухоли фон Гиппель-Линдау (VHL) является патогномонической ccRCC. Однако не было создано клинически релевантных трансгенных мышей модели ccRCC. Цель юга этого протокола состоит в том, чтобы внедрить и сравнить две вновь созданные модели животных для метастатического ccRCC. Во-первых, почечная имплантация в модели мыши. В нашей лаборатории система редактирования генов CRISPR была использована для выбивания гена VHL в нескольких линиях клеток RCC. Ортотопическая имплантация неоднородных популяций ccRCC в почечную капсулу создала новые модели ccRCC, которые развивают надежные метастазы легких у иммунокомпетентных мышей. Вторая модель – система куриной хориоаллантоической мембраны (CAM). По сравнению с моделью мыши, эта модель больше времени, труда и экономически эффективным. Эта модель также поддерживала надежное образование опухоли и интравазацию. Из-за короткого 10-дневного периода роста опухоли в CAM, никаких явных метастаз не наблюдалось иммуногистохимией (IHC) в собранных тканях эмбриона. Однако, когда рост опухоли был продлен на две недели в вылупившихся курица, микрометатические поражения ccRCC наблюдались IHC в легких. Эти две новые доклинические модели будут полезны для дальнейшего изучения молекулярного механизма метастазов, а также для создания новых, полученных пациентом ксенотрансплантатов (PDXs) к разработке новых методов лечения метастатического ccRCC.
Introduction
Карцинома почечных клеток (RCC) является7-м наиболее распространенным раком в Соединенных Штатах. Ежегодно, 74000 американцев, по оценкам, вновь диагностируется, что составляет более 14000 смертей (Ясно-клеточный гистологический подтип, или ccRCC, является наиболее распространенным подтипом, на долю которого приходится около 80% случаев RCC. Пациенты с локализованной злокачественностью лечатся нефрэктомией и имеют благоприятную 5-летнюю выживаемость 73%1. Тем не менее, 25%-30% пациентов развиваются отдаленные метастаза в жизненно важные органы, такие как легкие, в результате чего плохое среднее выживание 13 месяцев и 5-летняя выживаемость только 11%1,2,3. Дальнейшее понимание метастатического механизма необходимо для улучшения смертельного исхода для метастатического ccRCC.
Потеря гена супрессора опухоли VHL является отличительной чертой генетического поражения наблюдается в большинстве случаев ccRCC человека4,5,6,7. Однако точный онкогенный механизм потери ВХЛ в ccRCC неизвестен. Кроме того, статус выражения VHL не является предсказуемым исхода в ccRCC8. Примечательно, что, несмотря на многочисленные попытки почечно-эпителиальной целевой VHL нокаут, ученые не смогли создать почечной аномалии за пределами неопластических кистозных поражений наблюдается у мышей9, даже в сочетании с удалением других супрессоров опухоли, такие как PTEN и p5310. Эти выводы подтверждают идею о том, что потери ВХЛ сами по себе недостаточно для опухоли или последующего спонтанного метастаза.
Недавно наша лаборатория создала новую линию клеток VHL knockout (VHL-KO) с использованием CRISPR/Cas9 опосредованного удаления гена VHL в линии клеток MURINE VHL ‘ ccRCC (RENCA, или VHL-WT)11,12. Мы показали, что VHL-KO является не только мезенхимальным, но и способствует эпителии к мезенхимального перехода (EMT) вВХЛ-WT клеток12. ИЗВЕСТНО, что EMT играет важную роль в метастатическом процессе13. Наша работа также показала, что отдаленные метастазирование легких происходит только при совместном имплантации в почках вВХЛ-КО и ВХЛ-ВТ, поддерживая кооперативный механизм метастазирования. Важно отметить, что наша ортотопически имплантированная модель VHL-KO и VHL-WT приводит к устойчивым метастазам легких, повторяя клинические случаи ccRCC. Эта спонтанная метастатическая модель ccRCC компенсирует отсутствие трансгенной метастатической мышиной модели, особенно при разработке новых противметастатов. Этот протокол демонстрирует имплантацию почечной капсулы неоднородных клеточных популяций генетически модифицированных клеток RENCA.
Куриные модели CAM имеют долгую историю в исследованиях ангиогенеза и биологии опухоли из-за их многочисленных преимуществ, как обобщено в таблице 114,15,16,17,18. Короче говоря, временное окно для роста опухоли CAM является коротким, что позволяет максимум 11 дней, пока CAM разрушается при вылуплении курицы16. Несмотря на короткое время роста, богатое питание и иммунодефицитное состояние куриного эмбриона позволяют очень эффективно привить опухоль16,19,20,21. Наконец, стоимость каждой оплодотворенной яйцеклетки составляет 1 евро по сравнению с более чем 100 долларами за мышь SCID. Вместе модель CAM может служить ценной альтернативной моделью для животных в создании новых PDX при большой экономии времени и затрат по сравнению с мышью. В этом протоколе мы оценивали, удалось ли модели резюмировать биологию метастатического ccRCC, наблюдаемого в ортотопической модели мыши.
| (SCID) Мыши | Камера | Примечание | |
| Стоимость | 100 долларов США каждый | 1$1 каждый | Выживаемость от 50-75% |
| Потребность в барьерном жилье | Да | Нет | Дальнейшее снижение затрат и упрощение последовательного мониторинга опухолей |
| Опухоль непосредственно видна | Нет | Да | Рисунок 3A |
| Время для первого прививоки (RENCA) | 2 недели | 2-4 дня | реф 14, 15 |
| Конечная точка роста (RENCA) | 3-6 недель | 10 дней | реф 14, 15 |
| Метастаз (RENCA) наблюдается | Да | Да у цыплят | Рисунок 3D |
| Серийные проходы | Да | Да | рефери 16-18 |
| Проход к мышам (RENCA) | Да | Да | Hu, J., et al. в стадии рассмотрения (2019) |
| Поддержание неоднородности опухоли | Да | Да | Hu, J., et al. в стадии рассмотрения (2019) |
Таблица 1: Преимущества и ограничения моделей мыши и CAM. В этой таблице сравниваются две модели по их преимуществам и ограничениям с точки зрения требуемого времени, затрат, труда, а также биологии. Модель CAM имеет преимущества в эффективности, но она также имеет свои собственные уникальные ограничения из-за различных морфологии между птицами и млекопитающими. Поэтому важно подтвердить, что модель может сохранить биологию ксенотрансвантов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для многих пациентов с эпителиальными злокачественными новообразованиями метастазы в жизненно важные органы являются основной причиной смертности. Поэтому необходимо найти основной механизм и новый путь терапии метастатических заболеваний. К сожалению, не хватает соответствующих ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована за счет гранта UCLA JCCC семян, UCLA 3R грант, UCLA CTSI, и UC TRDRP (LW). Мы благодарим Доклинический Центр визуализации Института Крамп, TPCL и отдел лабораторной медицины для животных Калифорнийского университета (DLAM) за помощь в экспериментальных методах. Поток цитометрии была выполнена в UCLA Джонсон Всеобъемлющий онкологический центр (JCCC) и Центр по исследованию СПИДа поток цитометрии Основной фонд, который поддерживается Национальными институтами здравоохранения награды P30 CA016042 и 5P30 AI028697, а также JCCC, UCLA Институт СПИДа, Дэвид Геффен школы медицины в Калифорнийском университете, UCLA канцлера. Статистические консультации и услуги анализа данных были предоставлены UCLA CTSI биостатистика, эпидемиология, и научно-исследовательский дизайн (BERD) Программа, которая поддерживается NIH / Национальный центр по продвижению трансляционной науки UCLA CTSI Грант номер UL1TR001881.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. . Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, (1971).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2019).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. . Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
