Comparación de metastática célula sin fin renal Modelo establecido en el riñón del ratón y en la membrana chorioalantoica del pollo
Summary
El carcinoma metastásico de células renales de células claras es una enfermedad sin un modelo animal completo para una investigación preclínica exhaustiva. Este protocolo ilustra dos nuevos modelos animales para la enfermedad: el modelo de ratón implantado ortopédicamente y el modelo de membrana corioalantoica de pollo, que demuestran metástasis pulmonar similar a los casos clínicos.
Abstract
El carcinoma metastásico de células renales de células claras (CCRCC) es el subtipo más común de cáncer de riñón. El ccRCC localizado tiene un resultado quirúrgico favorable. Sin embargo, un tercio de los pacientes con CCCC desarrollarán metástasis en el pulmón, lo que está relacionado con un resultado muy pobre para los pacientes. Desafortunadamente, no hay terapia disponible para esta etapa mortal, porque el mecanismo molecular de la metástasis sigue siendo desconocido. Se sabe desde hace 25 años que la pérdida de la función del gen supresor tumoral von Hippel-Lindau (VHL) es patognomónica de ccRCC. Sin embargo, no se ha generado ningún modelo de ratón transgénico clínicamente relevante de ccRCC. El propósito de este protocolo es introducir y comparar dos modelos animales de nueva creación para ccRCC metastásico. La primera es la implantación renal en el modelo de ratón. En nuestro laboratorio, el sistema de edición de genes CRISPR se utilizó para eliminar el gen VHL en varias líneas celulares RCC. La implantación ortotópica de poblaciones heterogéneas de CCCC en la cápsula renal creó nuevos modelos de CCCc que desarrollan metástasis pulmonares robustas en ratones inmunocompetentes. El segundo modelo es el sistema de membrana corioalantoica de pollo (CAM). En comparación con el modelo de ratón, este modelo es más tiempo, mano de obra y rentable. Este modelo también soportaba la formación robusta de tumores y la intravasación. Debido al corto período de 10 días de crecimiento tumoral en CAM, no se observó metástasis abierta por inmunohistoquímica (IHC) en los tejidos embrionarios recogidos. Sin embargo, cuando el crecimiento del tumor se extendió por dos semanas en el pollo eclosionado, el IHC observó lesiones de CCRCC micrometastásicas en los pulmones. Estos dos nuevos modelos preclínicos serán útiles para seguir estudiando el mecanismo molecular detrás de la metástasis, así como para establecer nuevos xenoinjertos derivados del paciente (PDX) para el desarrollo de nuevos tratamientos para el CCRCC metastásico.
Introduction
El carcinoma de células renales es el7o cáncer más común en los Estados Unidos. Anualmente, se estima que 74.000 estadounidenses son diagnosticados recientemente, representando más de 14,000 muertes (subtipo histológico de células claras, o CCCC, es el subtipo más común, representando aproximadamente el 80% de los casos de CCR. Los pacientes con neoplasia maligna localizada son tratados con nefrectomía y tienen una tasa de supervivencia favorable de 5 años del 73%1. Sin embargo, el 25%-30% de los pacientes desarrollan metástasis distantes en órganos vitales como los pulmones, lo que resulta en una pobre supervivencia media de 13 meses y una tasa de supervivencia a 5 años de sólo 11%1,2,3. Se necesita una mayor comprensión del mecanismo metastásico para mejorar el resultado mortal de la CCRCC metastásica.
La pérdida del gen supresor de tumores VHL es una lesión genética distintiva observada en la mayoría de los casos de CCRCChumanos 4,5,6,7. Sin embargo, se desconoce el mecanismo oncogénico preciso de la pérdida de VHL en ccRCC. Además, el estado de la expresión VHL no es predictivo del resultado en ccRCC8. En particular, a pesar de los numerosos intentos de eliminación de VHL dirigido a la isla- epitelial, los científicos no han podido generar anormalidad renal más allá de las lesiones quísticas preneoplásicas observadas en ratones9,incluso cuando se combinan con la deleción de otros supresores tumorales como PTEN y p5310. Estos hallazgos apoyan la idea de que la pérdida de VHL por sí sola es insuficiente para la tumorigenesis o la metástasis espontánea subsiguiente.
Recientemente, nuestro laboratorio creó una nueva línea celular de nocaut VHL (VHL-KO) utilizando la deleción mediada por CRISPR/Cas9 del gen VHL en la línea celular murine VHL+ ccRCC (RENCA, o VHL-WT)11,12. Hemos demostrado que VHL-KO no sólo es mesenquimal, sino que también promueve la transición epitelial a mesenquimal (EMT) de las células VHL-WT12. Se sabe que la EMT desempeña un papel importante en el proceso metastásico13. Nuestro trabajo demostró además que la metástasis pulmonar distante ocurre sólo con la coimplantación de células VHL-KO y VHL-WT en el riñón, apoyando un mecanismo cooperativo de metástasis. Es importante destacar que nuestro modelo VHL-KO y VHL-WT implantado ortopédicamente conduce a metástasis pulmonares robustas, recapitulando los casos clínicos de ccRCC. Este modelo de ccRCC metastásico espontáneo compensa la falta de un modelo de ratón metastásico transgénico, especialmente en el desarrollo de nuevos fármacos anti-metástasis. Este protocolo demuestra la implantación de cápsulas renales de las poblaciones de células heterogéneas de células RENCA de ingeniería genética.
Los modelos CAM de pollo tienen una larga historia en investigación para la angiogénesis y la biología tumoral debido a sus numerosas ventajas, como se resume en la Tabla 114 14,15,16,17,18. Brevemente, la ventana de tiempo para el crecimiento del tumor CAM es corta, permitiendo un máximo de 11 días hasta que el CAM se destruye al eclosionar el pollo16. A pesar del corto tiempo de crecimiento, el rico suministro de nutrición y el estado inmunodeficiente del embrión de pollo permiten un injerto tumoral muy eficiente16,19,20,21. Por último, el costo de cada óvulo fertilizado es de 1,1, en comparación con más de 100 dólares para un ratón SCID. Juntos, el modelo CAM puede servir como un valioso modelo animal alternativo en el establecimiento de nuevos PDX a un gran ahorro en tiempo y costo en comparación con el ratón. En este protocolo, evaluamos si el modelo fue capaz de recapitular la biología de ccRCC metastásico observado en el modelo ortotópico de ratón.
| (SCID) Ratón | Cam | Nota | |
| Costo | >$100 cada uno | $1 cada uno | Viabilidad que van desde 50-75% |
| Necesidad de vivienda en barrera | Sí | No | Reduce aún más los costos y simplifica la monitorización en serie de los tumores |
| Tumor directamente visible | No | Sí | Figura 3A |
| Tiempo hasta el primer injerto (RENCA) | 2 semanas | 2-4 días | ref 14, 15 |
| Punto final de crecimiento (RENCA) | 3-6 semanas | 10 días | ref 14, 15 |
| Metastasis (RENCA) observada | Sí | Sí en las chicas | Figura 3D |
| Pasajes en serie | Sí | Sí | referencia 16-18 |
| Paso a ratones (RENCA) | Sí | Sí | Hu, J., et al. under review (2019) |
| Mantener la heterogeneidad tumoral | Sí | Sí | Hu, J., et al. under review (2019) |
Tabla 1: Ventajas y limitaciones de los modelos de ratón y CAM. Esta tabla compara los dos modelos por sus ventajas y limitaciones en términos de tiempo requerido, costo, mano de obra, así como la biología. El modelo CAM tiene ventajas en eficiencia, pero también tiene sus propias limitaciones únicas debido a la diferente morfología entre aves y mamíferos. Por lo tanto, es importante confirmar que el modelo puede retener la biología de los xenoinjertos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para muchos pacientes con neoplasias malignas epiteliales, la metástasis en órganos vitales es la causa principal de la mortalidad. Por lo tanto, es esencial encontrar el mecanismo subyacente y una nueva vía de terapia para la enfermedad metastásica. Desafortunadamente, hay una falta de modelos animales ccRCC metastásicos relevantes. El desafío en gran parte se debe a la incapacidad de recrear ccRCC en ratones a pesar de la generación de numerosos modelos transgénicos de ratón vHL knockout9</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la subvención de semillas ucLA JCCC, la subvención UCLA 3R, UCLA CTSI y UC TRDRP (LW). Agradecemos a la Instalación de Imágenes Preclínicas del Instituto Crump, el TPCL y el Departamento de Medicina Animal de Laboratorio (DLAM) de UCLA por su ayuda con métodos experimentales. La citometría de flujo se realizó en el Centro Integral del Cáncer de UCLA Johnson (JCCC) y en el Centro de Centro de Citometría de Investigación del SIDA, que cuenta con el apoyo de los premios P30 CA016042 y 5P30 AI028697, y por el JCCC, el Instituto de SIDA de UCLA, la Escuela de Medicina David Geffen de UCLA, la Cancillería de la UCLA y la Vicerrectora de Investigación de la UCLA. La consultoría estadística y los servicios de análisis de datos fueron proporcionados por el Programa de Bioestadística, Epidemiología y Diseño de Investigación (BERD) de UCLA CTSI que cuenta con el apoyo del NIH/Centro Nacional para el Avance de la Ciencia Traslacional UCLA CTSI Número de Subvención UL1TR001881.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
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