Vergleich von metastasierenden klaren Zell Nierenzellkarzinom Modell in Maus Niere und auf Huhn Chorioallantoic Membran etabliert
Summary
Metastasierendes blutestes Nierenzellkarzinom ist eine Krankheit ohne umfassendes Tiermodell für eine gründliche präklinische Untersuchung. Dieses Protokoll veranschaulicht zwei neuartige Tiermodelle für die Krankheit: das orthototisch implantierte Mausmodell und das Hähnchen-Chorioallanto-Membranmodell, die beide Lungenmetastasen zeigen, die klinischen Fällen ähneln.
Abstract
Metastasierendes klarzellrenales Zellkarzinom (ccRCC) ist der häufigste Subtyp von Nierenkrebs. Lokalisiertes ccRCC hat ein günstiges chirurgisches Ergebnis. Ein Drittel der ccRCC-Patienten wird jedoch Metastasen zur Lunge entwickeln, was mit einem sehr schlechten Ergebnis für die Patienten zusammenhängt. Leider gibt es für dieses tödliche Stadium keine Therapie, da der molekulare Mechanismus der Metastasierung unbekannt bleibt. Seit 25 Jahren ist bekannt, dass der Funktionsverlust des von Hippel-Lindau (VHL) Tumorsuppressorgens pathognomisch von ccRCC ist. Es wurde jedoch kein klinisch relevantes transgenes Mausmodell von ccRCC erzeugt. Ziel dieses Protokolls ist es, zwei neu eingerichtete Tiermodelle für metastasierende ccRCC einzuführen und zu vergleichen. Die erste ist die Nierenimplantation im Mausmodell. In unserem Labor wurde das CRISPR-Gen-Editing-System verwendet, um das VHL-Gen in mehreren RCC-Zelllinien auszuschalten. Orthotopische Implantation heterogener ccRCC-Populationen in die Nierenkapsel schuf neuartige ccRCC-Modelle, die robuste Lungenmetastasen bei immunkompetenten Mäusen entwickeln. Das zweite Modell ist das Chicken Chorioallantoic Membrane (CAM) System. Im Vergleich zum Mausmodell ist dieses Modell zeit-, arbeits- und kosteneffizienter. Dieses Modell unterstützte auch eine robuste Tumorbildung und Intravasation. Aufgrund der kurzen 10-tägigen Phase des Tumorwachstums in CAM wurde durch die Immunhistochemie (IHC) in den gesammelten Embryogeweben keine unverhakten Metastasen beobachtet. Als jedoch das Tumorwachstum beim geschlüpften Huhn um zwei Wochen verlängert wurde, wurden mikrometastatische ccRCC-Läsionen von IHC in der Lunge beobachtet. Diese beiden neuartigen präklinischen Modelle werden nützlich sein, um den molekularen Mechanismus hinter Metastasen weiter zu untersuchen und neue, patientenabgeleitete Xenografts (PDXs) zur Entwicklung neuartiger Behandlungen für metastasierendes ccRCC zu etablieren.
Introduction
Nierenzellkarzinom (RCC) ist die7. häufigste Krebsart in den Vereinigten Staaten. Jährlich werden schätzungsweise 74.000 Amerikaner neu diagnostiziert, was mehr als 14.000 Todesfällen entspricht (der histologische Untertyp clear-cell, kurz ccRCC, ist der häufigste Subtyp, der etwa 80% der RCC-Fälle ausmacht. Patienten mit lokalisierter Malignität werden mit Nephrektomie behandelt und haben eine günstige 5-Jahres-Überlebensrate von 73%1. Jedoch, 25%-30% der Patienten entwickeln entfernte Metastasen zu lebenswichtigen Organen wie der Lunge, was zu einem schlechten mittleren Überleben von 13 Monaten und 5-Jahres-Überlebensrate von nur 11%1,2,3. Ein besseres Verständnis des metastasierenden Mechanismus ist erforderlich, um das tödliche Ergebnis für metastasierende ccRCC zu verbessern.
Der Verlust des VHL-Tumorsuppressorgens ist ein Kennzeichen genetischer Läsion, das in der Mehrzahl der menschlichen ccRCC-Fälle4,5,6,7beobachtet wird. Der genaue onkogene Mechanismus des VHL-Verlustes in ccRCC ist jedoch unbekannt. Außerdem ist der VHL-Ausdrucksstatus nicht vorhersagbar für das Ergebnis in ccRCC8. Bemerkenswert ist, dass es den Wissenschaftlern trotz zahlreicher Versuche von renal-epithelialen VHL-Knockout nicht gelungen ist, Nierenanomalien jenseits der präneoplastischen zystischen Läsionen zu erzeugen, die bei Mäusen9beobachtet wurden, selbst wenn sie mit der Deletion anderer Tumorsuppressoren wie PTEN und p5310kombiniert werden. Diese Ergebnisse stützen die Vorstellung, dass VHL-Verlust allein für die Tumorgenese oder die anschließende spontane Metastasierung nicht ausreicht.
Kürzlich hat unser Labor eine neue VHL-Knockout-Zelle (VHL-KO) mit CRISPR/Cas9-vermittelter Deletion des VHL-Gens in der murinen VHL+ ccRCC-Zelllinie (RENCA, oder VHL-WT)11,12erstellt. Wir zeigten, dass VHL-KO nicht nur mesenchymal ist, sondern auch epitheliale zu mesenchymalen Übergängen (EMT) von VHL-WT-Zellen12fördert. EMT spielt bekanntlich eine wichtige Rolle im metastasierenden Prozess13. Unsere Arbeit zeigte weiter, dass entfernte Lungenmetastasen nur mit der Koimplantation von VHL-KO- und VHL-WT-Zellen in der Niere auftreten und einen kooperativen Mechanismus der Metastasierung unterstützen. Wichtig ist, dass unser orthotopisch implantiertes VHL-KO- und VHL-WT-Modell zu robusten Lungenmetastasen führt, die die klinischen ccRCC-Fälle rekapitulieren. Dieses spontane metastasierende ccRCC-Modell kompensiert das Fehlen eines transgenen metastasierenden Mausmodells, insbesondere bei der Entwicklung neuartiger Antimetastasen-Medikamente. Dieses Protokoll zeigt die renale Kapselimplantation der heterogenen Zellpopulationen genetisch entwickelter RENCA-Zellen.
Hühner-CAM-Modelle haben eine lange Geschichte in der Forschung für Angiogenese und Tumorbiologie aufgrund ihrer zahlreichen Vorteile, wie in Tabelle 114,15,16,17,18zusammengefasst. Kurz gesagt, das Zeitfenster für DAS CAM-Tumorwachstum ist kurz, so dass maximal 11 Tage, bis das CAM beim Schlüpfen des Huhns zerstört wird16. Trotz der kurzen Wachstumszeit ermöglichen die reichhaltige Nahrungsversorgung und der immundefiziierende Zustand des Hühnerembryons eine sehr effiziente Tumortransplantation16,19,20,21. Schließlich betragen die Kosten für jedes befruchtete Ei 1 USD, verglichen mit über 100 USD für eine SCID-Maus. Zusammen kann das CAM-Modell als wertvolles alternatives Tiermodell bei der Etablierung neuer PDXs zu einer großen Zeit- und Kostenersparnis im Vergleich zur Maus dienen. In diesem Protokoll haben wir untersucht, ob das Modell in der Lage war, die Biologie des metastasierenden ccRCC zu rekapitulieren, die im orthotopischen Mausmodell beobachtet wurde.
| (SCID) Maus | Cam | Hinweis | |
| Kosten | > 100 € pro Stück | 1 $ pro Stück | Lebensfähigkeit von 50-75% |
| Bedarf an Barrieregehäuse | Ja | Nein | Weitere Kosten reduziert und vereinfacht die serielle Überwachung der Tumore |
| Tumor direkt sichtbar | Nein | Ja | Abbildung 3A |
| Zeit zur ersten Engraftment (RENCA) | 2 Wochen | 2-4 Tage | Ref 14, 15 |
| Endpunkt des Wachstums (RENCA) | 3-6 Wochen | 10 Tage | Ref 14, 15 |
| Metastasen (RENCA) beobachtet | Ja | Ja in Küken | Abbildung 3D |
| Serielle Passagen | Ja | Ja | Ref 16-18 |
| Durchgang zu Mäusen (RENCA) | Ja | Ja | Hu, J., et al. im Rückblick (2019) |
| Erhaltung der Tumorheterogenität | Ja | Ja | Hu, J., et al. im Rückblick (2019) |
Tabelle 1: Vorteile und Einschränkungen der Maus- und CAM-Modelle. Diese Tabelle vergleicht die beiden Modelle hinsichtlich ihrer Vorteile und Einschränkungen in Bezug auf benötigte Zeit, Kosten, Arbeit sowie die Biologie. Das CAM-Modell hat Vorteile in der Effizienz, hat aber auch seine eigenen einzigartigen Grenzen aufgrund der unterschiedlichen Morphologie zwischen Vögeln und Säugetieren. Daher ist es wichtig zu bestätigen, dass das Modell die Biologie der Xenografts beibehalten kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für viele Patienten mit epithelialen Malignitäten ist Metastasierung zu lebenswichtigen Organen die Hauptursache für die Sterblichkeit. Daher ist es wichtig, den zugrunde liegenden Mechanismus und einen neuen Therapieweg für metastasierende Erkrankungen zu finden. Leider fehlt es an relevanten metastasierenden ccRCC-Tiermodellen. Die Herausforderung ist zu einem großen Teil auf die Unfähigkeit zurückzuführen, ccRCC bei Mäusen trotz der Erzeugung zahlreicher transgener Nierenepithel-gezielten VHL-Knockout-Mausmod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das UCLA JCCC Seed Grant, UCLA 3R Grant, UCLA CTSI und UC TRDRP (LW) finanziert. Wir danken der Preclinical Imaging Facility des Crump Institute, der TPCL und der UCLA Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) für ihre Hilfe bei experimentellen Methoden. Die Flow-Zytometrie wurde im UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) und im Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility durchgeführt, die von den National Institutes of Health Awards P30 CA016042 und 5P30 AI028697 sowie vom JCCC, dem UCLA AIDS Institute, der David Geffen School of Medicine an der UCLA, dem UCLA Chancellor es Office und dem UCLA Vizekanzler unterstützt wird. Die Statistikberatung und Datenanalyse wurde vom UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiology, and Research Design (BERD) Programm bereitgestellt, das vom NIH/National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881 unterstützt wird.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
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