כרונית, חריפה, ו-HIV ההפעלה מופעל מודלים העכבר חיסוני הומניזציה
Summary
המתואר כאן הם שלוש גישות ניסיוני ללמוד את הדינמיקה של זיהום HIV בעכברים הומניזציה. הראשון מתיר את המחקר של אירועי זיהום כרונית, בעוד שני האחרונים מאפשר לימוד של אירועים חריפים לאחר זיהום ראשוני או נגיפי ההפעלה מראש.
Abstract
בסיס הומניזציה/מזהה/IL-2 הקולטן γ עכבריםnull לאחר כמה תכונות של חסינות האדם, אשר ניתן לנצל במחקר בסיסי וטרום קליני על מחלות זיהומיות. מתוארים כאן הם שלושה מודלים של עכברים הומניזציה לקויה לחקר הדינמיקה של נגיף ה-HIV. הראשון מבוסס על הזרקה התוך הכבד של CD34+ תאי גזע המטפאות בעכברים היילוד, אשר מאפשר את החוקה של מספר התאים ורקמות הלימפה מוגבלים, ואחריו זיהום עם התייחסות מאמץ HIV. מודל זה מאפשר ניטור עד 36 שבועות לאחר ההדבקה ולכן נקרא מודל כרונית. המודלים השני והשלישי מכונים מודלים חריפה ומהירים, בהם תאי דם היקפיים הintraperitoneally מוזרק לעכברים מבוגרים. במודל החריף, תאים מתורם בריא מעפילו דרך התוואי התוך-הצפק, ולאחריו זיהום עם התייחסות למתח HIV. בסופו של דבר, במודל ההפעלה מההתחלה, תאים מתורם הנגוע באיידס תחת הטיפול האנטי-ויראלי מנחטרים באמצעות תוואי הצפק. במקרה זה, סביבה נטולת סמים בעכבר מאפשר ההפעלה מחודש וירוס ועלייה בעומס נגיפי. הפרוטוקולים המסופקים כאן לתאר את הגישה הניסיונית קונבנציונאלי עבור הומניזציה, מודלים העכבר החיסוני של נגיף ה-HIV.
Introduction
הומניזציה/SCID/אינטרלוקין (IL)-2 קולטן γ-שרשרתnull (להלן המכונה ההונים γ-שרשרתnull) מודל העכבר כבר בשימוש נרחב לחקר הפתוגנזה של זיהומים, חסינות אוטומטית, סרטן, כמו גם עבור מחקרים פרה-קליניים של תרופות, האדם תאים מבוססי טיפולים1,2. עכברים אלה מבוססים על רקע שאינו מהשמנת יתר (נוד), עם מוטציה scid ו מוטציה ממוקד ב-il-2 קולטן γ-שרשרת (γ שרשרת משותפת עבור il-2, il-4, il-7, il-9, il-15, ו-il-21), אשר לגרום ליקוי חמור בפיתוח העכבר T-, B-, ו הרוצח הטבעי (NK) תאים1 לפיכך, הם תומכים בתאום של רקמת האדם, CD34 האדם+ תאי גזע המטפאות (HSCs), ותאי דם היקפיים מונפקטיים (pbmcs)3,4,5. בנוסף, ביטוי הטרנסגניים של גורמים המטבטיים האנושיים, כגון מקדם של תאי גזע (scf), גרנולוציט/מקרופאג המושבה-גורם מגרה (GM-שדרתי), ו-IL-3 מקדם את העפיתו של אוכלוסיות מיאלואידית האדם6,7,8.
עבור לימודי HIV, מודלים מסוימים של ההונים γ-שרשרתnull תוארו, אשר שונים במתח העכבר, סוג של תאים אנושיים בשימוש, סוג של רקמות עבור חרט, ואת המקור של תאים (כלומר, בריא vs. תורם נגוע באיידס)9,10. הזן המקורי, עם זאת, משמש באופן נרחב בשל רמות גבוהות של תאים אנושיים בתיאום ונגיפי שכפול לאחר זיהום עם התייחסות מאמץ HIV11,12,13. חיסוני דומה לקוי של העכבר עם ביטוי טרנסגניים של גורמים המטטיים האנושיים (g., חעוגה-exl או nsg-SGM3) או עם שתלים של הכבד האנושי רקמות בלוטת התימוס (העצם במח-כבד בלוטת התימוס [בייקון] עכברים) שימושיים להערכת התפקיד של אוכלוסיות מיאלואידית בתגובה החיסונית אנטי-HIV, ההשפעות של HIV על רקמות אלה, ואת השתתפותם כמו מאגריםויראלי 14,15. יתר על כן, כמה זנים עם ביטוי טרנסגניים של אנטיגן לוקיציט אנושי (hla) מולקולות, כמו גם עכברים, ניתן להשתמש ללמוד את התגובה לתאי T לזיהום איידס16,17.
באופן כללי, בעכברים האלה, הומניזציה תלוי במקור התאי, בתוואי המשלוח (בתוך הצפק, בתוך הכבד, בתוך ורידי, בתוך הבית) ובגיל העכבר בזמן המועד המקביל18,19,20. לגבי מקור התא, האדם CD34+ hsc נגזר דם טבורי, הכבד עובר, או מגוייס דם היקפי ניתן להזריק היילוד או הצעיר עכברים3,21. בנוסף, בוגרים γ-שרשרת העכבריםnull יכול להיות הומניזציה על ידי הזרקת pbmc (כאן, הנקרא hu-pbmc-NS γ-שרשרת העכבריםnull ), המאפשר המחזור הזמני של תאים אלה בדם, איברי הלימפה המשני, ורקמות מודלק22,23,24.
המתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור הקמתה של ההוני γ-שרשרת מודלים העכברnull למחקר של זיהום HIV. הראשון הוא המודל הכרוני, שבו האדם CD34+ HSCs נגזר דם טבורי מתורם בריא מוזרק עכברים היילוד, ואחריו זיהום עם התייחסות למתח HIV לאחר 14 שבועות של המערכת החיסונית האנושית מחדש החוקה. מודל זה מאפשר ניטור של עכברים עד ~ 36 שבועות לאחר ההדבקה. המודל השני הוא מודל אקוטי, שבו PBMCs נגזר תורם בריא מוזרק ב-NS למבוגרים γ-שרשרתריק עכברים, ואחריו זיהום עם מאמץ התייחסות HIV לאחר 3 שבועות של התרחבות האדם T-cell בעכבר. לבסוף, המודל השלישי הוא מודל ההפעלה מההתחלה, שבו pbmcs נגזר של תורם מזוהם HIV תחת הטיפול המדכא תרופתי (אמנות) מוזרק למבוגרים NS γ-שרשרתריק עכברים. במקרה זה, סביבה נטולת סמים מאפשרת ההפעלה ויראלי ולהגדיל את העומס הנגיפי. שני הדגמים האחרונים מאפשרים ניטור עד ~ 9 שבועות לאחר החרט.
בסך הכל, אלה שלושה מודלים שימושיים למחקרים virological, טרום קליני מחקרים של תרופות הרומן, והערכה של השפעות הזיהום של HIV על התגובה החיסונית הגלובלית. חשוב גם לשקול כי שימוש בעכברים נגועים באיידס הומניזציה דורש סקירה ואישור על ידי ועדת Biosafety טיחות מוסדית (IBC) כמו גם על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) לפני כל ניסוי. הדבר מבטיח כי המחקר מלווה בכל התקנות המוסדיות הפנימיות והחיצוניות לשימוש בחומרים ביולוגיים מסוכנים ובטיפול הומאני בבעלי חיים ניסיוניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
התפתחויות חשובות הושגו בפיתוח של זנים של העכבר החיסוני להאנשה, עם מספר אפשרויות שונות שניתן להשתמש על פי עניין המחקר1. בתנאי כאן הוא פרוטוקול כללי עבור הומניזציה של NS γ-שרשרת העכבריםnull זנים דומים גנטית להיות מועסק בשלושה מודלים שונים עבור לימוד זיהום HIV. בגישה הניסיונית …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי החטיבה הקלינית IHV קרנות פנימיות כדי JCZ.
Materials
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
References
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
- Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
- Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
- Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
- Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
- Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
- Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
- Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
- Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
- Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
- Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), 1-16 (2019).
- Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID “Meet the Experts” 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
- Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, 150-154 (2013).
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of “humanized” mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, 67-78 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
- Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
- Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
- Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
- Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), 1004-1014 (1994).
- Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , 15-24 (2015).
- Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
- Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
- Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
- Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
- Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, 155-159 (2013).
- Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
- Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
- Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).
