Pneumococcus infektion af primære humane endotelceller i konstant flow

Summary

Denne undersøgelse beskriver den mikroskopiske monitorering af pneumokokker-tilslutningen til von Willebrand-faktor strenge, der produceres på overfladen af differentierede humane primære endotelceller under forskydnings stress i definerede strømningsforhold. Denne protokol kan udvides til detaljeret visualisering af specifikke cellestrukturer og kvantificering af bakterier ved anvendelse af differentiale immunofarvnings procedurer.

Abstract

Interaktion af Streptococcus pneumoniae med overfladen af endotelceller er medieret i blodgennemstrømning via mekanisk følsomme proteiner såsom von Willebrand Factor (VWF). Dette glykoprotein ændrer sin molekylære konstellation som reaktion på forskydnings stress og udsætter derved bindingssteder for et bredt spektrum af Host-ligand-interaktioner. Generelt er dyrkning af primære endotelceller under en defineret forskydnings strøm kendt for at fremme den specifikke cellulære differentiering og dannelsen af et stabilt og tæt forbundet endotellag, der ligner fysiologien i den indvendige foring af et blodkar . Således kræver den funktionelle analyse af interaktioner mellem bakterielle patogener og værts Vaskulaturen, der involverer mekaniske følsomme proteiner, etablering af pumpesystemer, som kan simulere de fysiologiske strømnings kræfter, som vides at påvirke overfladen af vaskulære celler.

Den mikrofluidiske anordning, der anvendes i dette studie, muliggør kontinuerlig og Pulseless recirkulation af væsker med en defineret strømningshastighed. Det computerstyrede Lufttryks pumpesystem anvender en defineret forskydningsbelastning på endotelcellernes overflader ved at generere et kontinuerligt, envejs og kontrolleret medium flow. Morfologiske ændringer af cellerne og bakteriel fastgørelse kan mikroskopisk overvåges og kvantificeres i flowet ved hjælp af specielle kanal slides, der er designet til mikroskopisk visualisering. I modsætning til statisk cellekultur infektion, som generelt kræver en prøve fiksering forud for immun mærkning og mikroskopiske analyser, de mikrofluidisk dias muliggør både fluorescens-baserede påvisning af proteiner, bakterier, og cellulære komponenter efterprøve fiksering; seriel immunofluorescens farvning; og direkte fluorescens baseret detektion i realtid. I kombination med fluorescerende bakterier og specifikke fluorescens-mærkede antistoffer, denne infektion procedure giver en effektiv flere komponent visualisering system til et stort spektrum af videnskabelige applikationer relateret til vaskulære processer.

Introduction

Patogenesen af pneumokokker infektioner er karakteriseret ved en mangesidet interaktion med en mangfoldighed af ekstracellulære matrix forbindelser og komponenter i den menneskelige hæmostase, såsom plasminogen og vWF^{1,2, 3,4,5,6,7,8}. Multi Domain glykoprotein vWF fungerer som nøgle regulator af en balanceret hæmostase ved at mægle trombocyt rekruttering og fibrin inkorporering på stedet for vaskulær trombusdannelse⁹. Betydningen af funktionel, aktiv VWF til blødningskontrol og sårheling påvises ved von Willebrands sygdom, en almindelig arvelig blødningsforstyrrelse¹⁰.

Den globulære vWF cirkulerer i det menneskelige blod system i en koncentration på op til 14,0 μg/ml^11,10. Som reaktion på vaskulær skade, den lokale frigivelse af vWF af endotel Weibel Palade organer (WBP) er markant forøget^11,12. Tidligere undersøgelser viser, at pneumokokker overholdelse af humane endotelceller og dets produktion af pore dannende toksin pneumolysin i betydelig grad stimulerer luminale vWF sekretionen¹³. De hydrodynamiske kræfter i blodgennemstrømningen inducerer en strukturel åbning af mekanismens esponsive VWF domæner. Ved strømningshastigheder på 10 dyn/cm² vWF multimerizes til lange protein strenge på op til flere hundrede mikrometer i længden, der forbliver fastgjort til subendothelium^10,12.

For at forstå funktionen af multimeriserede vWF-strenge genereret under forskydnings stress i interaktionen af pneumokokker med endoteloverfladen blev der etableret en mikrofluidic-baseret cellekultur infektion tilgang. Der blev anvendt en mikrofluidic-enhed med et software kontrolleret lufttryk pumpesystem. Dette gav mulighed for en kontinuerlig, ensrettet recirkulation af cellekulturmedium med en defineret strømningshastighed. Derved anvendte systemet en defineret forskydningsbelastning på overfladen af endotelceller, som forblev fastgjort inde i specialiserede kanalrutschebaner. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at simuleringen af forskydnings kraften i blodstrømmen i det menneskelige vaskulære system, hvor VWF-strengene genereres på differentierede endotelceller under definerede konstante strømningsforhold. Til dette formål blev endotelcellerne dyrket i specifikke kanalrutschebaner (Se tabel over materialer), som blev tilpasset til mikroskopiske analyser under gennemstrømningen. Det mikrofluidisk pumpesystem leverede den meget definerede og kontrollerede forskydnings stresssituation, der kræves for dannelsen af udvidede vWF strenge på flydende endotheliale cellelag. Efter stimulering af VWF-sekretion af confluently dyrket humane navle formede vene endotelceller (HUVEC) af histamin tilskud, strengen dannelse blev induceret ved at anvende en shear stress (ԏ) af 10 dyn/cm². Forskydnings belastningen defineres som den kraft, der handler på cellelaget. Det beregnes omtrent efter Cornish et. al.¹⁴ med ligning 1:

Hvor ԏ = forskydningsbelastning i dyn/cm², η = viskositet i (dyn ∙ s)/cm², h = halvdelen af kanal højden, w = halvdelen af kanalbredden og Φ = flow hastigheds i ml/min.

Resultatet af ligning 1 afhænger af de forskellige højder og bredder på de forskellige anvendte slides (Se tabel over materialer). I dette studie blev der anvendt et luer-kanal udtræk på 0,4 μm, som resulterede i en kammer slide faktor på 131,6 (Se formel 2).

Viskositeten af mediet ved 37 °C er 0,0072 dyn ∙ s/cm ², og der blev anvendt en forskydningsbelastning på 10 dyn/cm ². Dette resulterede i en strømningshastighed på 10,5 mL/min (Se formel 3).

Her er tilpasningen og fremskridt af en mikrofluidisk celledyrkning procedure ved hjælp af et ensrettet laminar flow system til undersøgelse og visualisering af bakterielle infektions mekanismer i værts vasculaturen beskrevet i detaljer. Generering af VWF strenge på endotellag kan også stimuleres ved hjælp af andre pumpesystemer, der er i stand til at anvende en kontinuerlig og stabil shear stress¹⁵.

Efter dyrkning af primære endotelceller til sammenløbet i flow og stimulering af VWF-streng dannelse blev pneumokokker, der udtrykker rødt fluorescens protein (RFP)¹⁶ , føjet til endotelcellelag under konstant mikroskopisk kontrol. Tilknytningen af bakterier til VWF strenge på overfladen af endotelceller blev mikroskopisk visualiseret og overvåges i op til tre timer i realtid ved hjælp af VWF-specifikke fluorescerende-mærkede antistoffer. Med denne tilgang, rolle vWF som en vedhæftning cofaktor fremme bakteriel tilknytning til den vaskulære endotelum blev bestemt⁸.

Ud over den mikroskopiske visualisering af protein sekretion og konformationsmæssige ændringer, denne metode kan bruges til at overvåge enkelte trin af bakteriel infektion processer i realtid og at kvantificere mængden af vedhæftede bakterier på forskellige tidspunkter af Infektion. Det specifikke softwarestyrede pumpesystem giver også mulighed for at kultur de endotelceller i definerede konstante strømningsforhold i op til flere dage og muliggør en defineret pulseret medium flow inkubation. Desuden kan denne metode anvendes ved hjælp af forskellige celletyper. Tilpasning af farvnings protokollen giver også mulighed for påvisning og visualisering af bakterier internaliseret i eukaryote celler.

Dette manuskript beskriver denne avancerede eksperimentelle protokol, der kan bruges som en defineret, pålidelig og reproducerbar tilgang til en effektiv og alsidig karakterisering af patofysiologiske processer.

Protocol

Den mikrofluidiske celledyrkning blev udført med kommercielle primære humane navle vene endotheliale celler (HUVEC). Virksomheden isolerede cellerne med informeret samtykke fra donor. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for læger kammer i forbundsstaten Baden-Wuerttemberg med referencenummer 219-04. Bemærk: Se tabel over materialer til protokol forsyninger. 1. fordyrkning af primære endotelceller D…

Representative Results

Dyrkning primær HUVEC i en konstant ensrettede flow resulterer i dannelsen af en flydende og stramt pakket cellelag, der fremmer generering af cellulære wpbs fyldt med den mekanisosensitive vWF13,14. Denne protokol beskriver brugen af et lufttryk pumpe-baseret, Pulseless recirkulation system til infektion analyse, der kræver efterligne forskydnings stresssituation i den menneskelige blodgennemstrømning. Dette system muliggør en de…

Discussion

Simuleringen af bakteriel interaktion med mekanisnofølsomme værts proteiner som VWF kræver et perfbrugbart cellekultursystem, der muliggør generering af en defineret, ensrettet og kontinuerlig strøm af væsker, hvilket skaber pålidelig forskydningsbelastning . Flere mikrofluidisk pumpesystemer er allerede blevet beskrevet. En omfattende anmeldelse fra Bergmann et al. opsummerer de vigtigste aspekter af forskellige to-og tre-dimensionelle cellekultur modeller¹⁷.

De…

Materials

1 mL Luer-syringe	Fisher Scientific	10303002	with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe	Sarstedt	9077136	For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase	eBioscience now thermo fisher	00-4555-56	protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin	Abcam	ab176751	no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µl of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody	Thermo Fisher Sientific	A11001	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11011	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter	TPP	90026	subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	spinning down of bacteria (volumes of > 2mL)
Centrifuge Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 – Z 216 M	spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing	ibidi	10821	for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator	Fisher Scientific	MIDI 40	incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37°C and 5% CO2
CO2-Incubator	Sanyo	MCO-18 AIC	for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37°C
Colombia blood agar plates	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer	Dell	Latitude 3440	Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)	Leica	DMi8	An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	used for PBS buffer
Drying material	Merck	101969	orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix	Promocell	C-39215	supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 µg / mL heparin, 1 µg / mL Hydrocortisone
ECGMS	Promocell	C-22010	ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)	Promocell	C-22010	culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)	biochrome now Merck	S 0415	supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody	Abcam	ab8822	stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit	ibidi	10903	fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	for precoating of microslide channel surface
histamine dihydrochloride	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)	Santa Cruz	sc73268	stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port	ibidi	10820	for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope	Zeiss	Axiovert 35M	inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)	ibidi	80176	physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)	Sigma Aldrich	M7506-500G	For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump	ibidi	10905	air pressure pump
Neubauer cell counting chamber	Karl Hecht GmbH&Co KG	40442002	microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710-S	for cross linking of samples
Perfusion Set	ibidi	10964	Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37°C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)			the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes	Sarstedt	67,741	(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum	Pineda		raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate			this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)	ibidi	v1.5.4	Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
reaction tubes 1.5/ 2.0mL	Sarstedt	72.706/ 72.695.500	required for antibody dilutions
reaction tubes with 50 mL volume	Sarstedt	6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci	National Collection of Type Cultures, Public Health England	10,319	Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
serological pipets 5, 10 mL	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)	Sigma Aldrich	451614-25G	for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22	Biochrom	80-2115-20	measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G	for preparation of blocking buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract	oxoid	LP0021	bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY