본 연구는 정의된 흐름 조건에서 전단 응력 하에서 분화된 인간 1차 내피 세포의 표면에서 생성된 폰 윌레브란트 인자 문자열에 대한 폐렴구균 준수의 현미경 모니터링을 설명합니다. 이 프로토콜은 차동 면역 염색 절차를 적용하여 특정 세포 구조의 상세한 시각화 및 박테리아의 정량화로 확장 될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
내피 세포의 표면과 연쇄상 구균 폐렴의 상호 작용은 폰 윌레브란트 인자 (VWF)와 같은 메카노 민성 단백질을 통해 혈류에서 매개됩니다. 이 당단백질은 전단 응력에 반응하여 분자 변형을 변화시켜 광범위한 숙주-리간드 상호작용에 대한 결합 부위를 노출시킵니다. 일반적으로, 정의된 전단 흐름 하에서 1 차 내피 세포의 배양은 혈관의 내벽의 생리학을 닮은 안정적이고 단단히 연결된 내피 층의 특정 세포 분화 및 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. . 따라서, 세균성 병원체와 메카노민성 단백질을 포함하는 숙주 혈관구조 간의 상호작용의 기능적 분석은 표면에 영향을 미치는 것으로 알려진 생리적 유동력을 시뮬레이션할 수 있는 펌프 시스템의 확립을 요구한다. 혈관 세포.
이 연구에 사용된 미세 유체 장치는 정의된 유량으로 유체의 연속적이고 펄스없는 재순환을 가능하게 합니다. 컴퓨터 제어 식 공기 압 펌프 시스템은 연속, 단방향 및 제어 된 매체 흐름을 생성하여 내피 세포 표면에 정의 된 전단 응력적용합니다. 세포와 세균 부착의 형태학적 변화는 현미경 시각화를 위해 설계된 특수 채널 슬라이드를 사용하여 흐름에서 현미경으로 모니터링하고 정량화할 수 있습니다. 일반적으로 면역 표지 및 현미경 분석 전에 샘플 고정을 필요로하는 정적 세포 배양 감염과는 달리 미세 유체 슬라이드는 단백질, 박테리아 및 세포 성분의 형광 기반 검출을 모두 가능하게합니다. 샘플 고정 후; 직렬 면역 형광 염색; 실시간으로 직접 형광 기반 검출. 형광 박테리아 및 특정 형광 표지 항체와 함께,이 감염 절차는 혈관 과정과 관련된 과학적 응용 프로그램의 거대한 스펙트럼을위한 효율적인 다중 구성 요소 시각화 시스템을 제공합니다.
서론
폐렴구균 감염의 병인은 플라스미노겐 및 VWF 1,2와 같은 인간 지혈의 세포 외 매트릭스 화합물 및 구성 요소의 다양성과 다각적인 상호 작용을 특징으로합니다. 3,4,5,6,7,8. 다중 도메인 당단백질 VWF는 혈관 혈전 형성 부위에서 혈전세포 모집 및 피브린 혼입을 중재함으로써 균형 잡힌 지혈의 주요 조절자 역할을 한다9. 출혈 조절 및 상처 치유를 위한 기능적이고 활동적인 VWF의 중요성은 일반적인 상속된 출혈 장애 인 폰 윌레브란트 병10에의해 입증됩니다.
구형 VWF는 최대 14.0 μg/mL11,
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프로토콜
미세유체 세포 배양은 상업적인 일차인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)로 수행하였다. 회사는 기증자의 통보된 동의를 가진 세포를 고립시되었습니다. 이 연구는 참조 번호 와 연방 주 바덴 - 뷔르템베르크의 의사 상공 회의소의 윤리위원회에 의해 승인되었다 219-04.
참고: 프로토콜 소모품에 대한 재료 표를 참조하십시오.
1. 1 차 내피 세포의 사전 육성
- 37°C에서 3개의 다른 공여자로부터 1 x 10515차 HUVEC를 함유하는 냉동 글리세롤 바이알을 해동시키고, 25 cm2 세포 플라스크에서 7 mL의 내피 세포 성장 배지(ECGM, 보충제와 함께 사용할 준비)로 세포를 종자하였다.
참고: 1 차적인 내피 세포는 5 개 이상의 증식 주기 후에 분화 능력을 분실합니다. 따라서 5개 미만의 대지나 높은 등급의 세포 분화가 필요한 경우에만 사용할 수 있습니다. - 37°C에서 세포를 5%CO2 대기에서 60분 동안 배양하여 표면 부착을 허용하고 ECGM 세포 배양 배지를 교환하여 극저온 보존으로부터 잔류물을 제거....
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결과
일정한 단방향 흐름에서 1차 HUVEC를 배양하면, 메카노에민티드 VWF13,14로채워진 셀룰러 WPB의 생성을 촉진하는 풍부하고 단단히 포장된 세포층의 형성을 초래한다. 이 프로토콜은 인간의 혈류에서 전단 응력 상황을 모방해야 하는 감염 분석을 위해 공기압 펌프 기반의 펄스리스 재순환 시스템의 사용을 설명합니다.
이 시스템은 소프트웨어가 제어하는 흐름 조건을 정의하여 설정할 수 있습니다. 도 1의 흐름 방식은 1차 내피 세포의 전문화(도1,인셋 1)와 폐렴구균의 전생(그림1,인셋 2)으로 시작하는 주요 워크플로우를 도시한다. 적용된 미세유체 시스템(그림
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토론
VWF와 같은 메카노에민성 숙주 단백질과의 세균 상호 작용 시뮬레이션은 정의된 단방향 및 연속적인 액체 흐름을 생성할 수 있는 이난 세포 배양 시스템을 필요로 하며, 이로 인해 신뢰할 수 있는 전단 응력 생성 . 여러 미세 유체 펌프 시스템이 이미 설명되어 있습니다. Bergmann 외에서 포괄적인 검토는 상이한 2차원 및 3차원 세포 배양모델(17)의주요 측면을 요약한다.
미세 유체 기술은 1990 년대 초에 마이크로 미터와 심지어 나노 미터 규모18에서제어, 재현 성 및 투과 성 미세 환경의 개발로 시작된 매우 젊은 기술입니다. 제시된 미세 유체 접근법은 또한 광범위한 세균 접착 메커니즘 및 관련 단백질을 연구하기 위해 적용될 수 있다. VWF와 같은 메카노 반응 접착 성분을 포함하는 모든 상호 작용에 가장 적합하며, 일반적으로 표준 세포 배양 기술을 사용하여 접근할 수 없습니다. 예를 들어.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 프로젝트는 DFG (BE 4570/4-1)에 의해 S.B에 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 루어-시린 | Fisher Scientific | 10303002 | 슬라이드의 루어 연결을 사용한 젤라틴 주입용 1 mL |
| mL 루어-주사기 | Sarstedt | 9077136 | 채널 챔버 슬라이드의 루어 연결부에 유체를 피켤팅/주입하기 위해 |
| Accutase | eBioscience now Thermo Fisher | 00-4555-56 | 프로테아제 믹스 내피 세포의 부드러운 분리에 사용 |
| AlexaFluor350-conjugated Phalloidin | Abcam | ab176751 | 제조업체에서 사용할 수 있는 농도 없음, 재고 용액은 300 tets에 충분하며 회사는 100 µ를 사용하는 것이 좋습니다. L 1:1,000 희석, 청색 형광(DAPI 필터 설정) |
| AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse anti-body | Thermo Fisher Sientific | A11001 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence |
| AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-anti-rabbit-antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | 스톡 농도: pFA 고정 후 미세유체 슬라이드에서 폐렴구균의 면역 염색을 위한 2mg/mL, 적색 형광 |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | 복합 박테리아 배양 배지 |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | 가용, 차단 완충액 |
| 필터가 있는 세포 배양 플라스크 | TPP | 90026 | 25 cm2 표면의 코팅되지 않은 세포 배양 플라스크에서 HUVEC subcultivation |
| 원심분리기 Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | 박테리아 방사(>2mL 부피) |
| 원심분리기 Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | 진핵 세포 방사 |
| 원심분리기 Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 - Z 216 M | 박테리아의 회전 감소 (2 mL 미만의 부피) |
| Chloramphenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | 색 형광 단백질과 클로람페니콜 내성 카세트를 운반하는 유전자 구조로 변형 된 폐렴 구균의 배양을 위해 0.2 mg / mL의 농도로 사용 |
| 류 튜브 용 클램프 | ibidi | 10821 | 슬라이드를 펌프 시스템에 연결하기 전에 튜브에 액체를 보관 |
| CO2-Incubator | Fisher Scientific | MIDI 40 | 인큐베이터 크기는 연결된 채널 슬라이드가 있는 유체 장치의 크기에 완벽하게 맞게 조정되었으며 37°C에서 흐름 배양에 사용되었습니다. C 및 5 % CO2< / sub> |
| CO2< / sub>-Incubator | Sanyo | MCO-18 AIC | 5 % CO2< / sub> 및 37 °에서 정의 된 대기에서 박테리아 및 세포의 배양; C |
| 콜롬비아 혈액 한천 플레이트 | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | S. 폐렴용 한천 기반 복합 배양 배지에 7% 양 혈액 |
| 보충 압력 | Dell | Latitude 3440 | Comuter |
| 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) | Leica | DMi8 | 가열 가능한 챔버로 덮인 스테이지와 형광 필터, 제논 광원(SP8, DMi8) 및 DFC 365 FX 카메라(1392 x 1040, 1.4 메가픽셀) |
| Di 인산수소칼륨(KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, 칼스루에 | 3904.1 | PBS 완충액에 사용 |
| 건조 재료 | Merck | 101969 | 오렌지 실리카 비드 건조용 튜브 어댑터와 함께 유리병에 사용 |
| ECGM 보충제 믹스 | ECGM 매체용 Promocell | C-39215 | 보충제 믹스: 0.02mL/mL 태아 송아지 혈청, 0.004mL/mL 내피 세포 성장 보충제, 0.1ng/mL 표피 성장 인자, 1ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자, 90 &마이크로; g/mL 헤파린, 1 &마이크로; g/mL 하이드로코르티손 |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM 세포 접착력을 증가시키기 위해 5 % [w/w] FCS 및 1 mM MgSO4 보충 |
| 피 세포 성장 배지(ECGM, 즉시 사용 가능) | HUVEC의 Promocell | C-22010 | 배양 배지, 이미 보충제 믹스의 모든 구성 요소가 보충됨 |
| 태아 송아지 혈청(FCS) | 바이오크롬 현재 Merck | S 0415 | 감염 분석에 사용되는 세포 배양을 위한 보충제 |
| FITC-conjugated goat anti-human VWF 항체 | Abcam | ab8822 | 스톡 농도: 10 mg/mL, 유동 중 구형 및 다중합체 VWF의 면역검출용 |
| 유체 단위 | ibidi | 10903 | 유동 배양을 위한 유체 장치 |
| 젤라틴(돼지) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | 마이크로슬라이드 채널 표면의 사전 코팅용 |
| 히스타민 디하이드로클로라이드 | 시그마 알드리치 | H-7250-10MG | 내피 내에서 VWF 분비 유도 Weibel Palade Bodies |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | 1 차 내피 세포 풀링 된 기증자에서 액체 질소에 보관 |
| 인간 VWF 특이 항체 (단클론) | Santa Cruz | sc73268 | 재고 농도 : 200 µ PFA 고정 후 미세유체 슬라이드에서 VWF의 면역 염색을 위한 g/mL |
| 주입 Port | ibidi | 10820 | 흐름 순환 중 저장소 튜브에 히스타민 또는 박테리아 주입 |
| 광학 현미경 | Zeiss | Axiovert 35M | 반광 현미경: 40x 물 대물렌즈를 사용하여 진핵 세포 분리 및 세포 계수 제어, 400배 배율 허용 |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | fludic 재배를 위한 물리적으로 변형된 슬라이드 (μ – 채널 높이가 0.4mm이고 채널 볼륨이 100>인 슬라이드 I0.42) 모든 종류의 유동 분석에 적합, 물리 처리는 친수성 및 접착성 표면을 생성합니다. |
| 황산마그네슘(MgSO4, unhydrated) | Sigma Aldrich | M7506-500G | ECGMS 매체 |
| 미세유체 펌프 | 제조용 ibidi | 10905 | 기압 펌프 |
| Neubauer 세포 계수 챔버 | Karl Hecht GmbH& Co KG | 40442002 | HUVECs |
| Paraformaldehyde 16 % (PFA) | 샘플의 교차 연결을위한 | 전자 현미경 검사 과학 | 15710-S |
| 관류 세트 | ibidi | 10964 | 관류 세트 황색 / 녹색은 튜브 직경 1.6mm, 튜브 길이 50cm, 총 작업 부피 13.6mL, 데드 튜브 부피 2.8mL 및 저장소 크기 10mL. µ-slide L0.4Luer와 결합, 37 °에서; C 및 점도 0.0072 dyn x s/cm2 3.8mL/min의 유속 범위 최대 33.9mL/min, 3.5dyn/cm2 및 31.2dyn/cm2 사이의 전단 응력에 도달할 수 있습니다. microfluidic |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | 로 해결책은 뒤에 오는 화학물질을 사용하여 준비되었다: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4, pH 7.4 | ||
| 플라스틱 큐벳 | Sarstedt | 67,741 | (2 x 광학) 600nm |
| 폐렴구균 특이적 항혈청 | Pineda | 열 비활성화 연쇄상구균 폐렴균 NCTC10319 및 D39, proteinA-sepharose 컬럼을 사용하여 IgG 정제. | |
| 폴리스티렌 또는 스티로폼 플레이트 | 이것은 채널 슬라이드에 파종된 세포에 대한 차가운 스트레스를 피하기 위한 예방 조치입니다. 포장 상자 재료와 같은 모든 유형의 스티로폼을 사용할 수 있습니다. 접시의 두께는 0.5cm일 수 있으며 크기는 20cm2이어야 합니다. | ||
| 염화칼륨 (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | PBS 버퍼에 사용 |
| 펌프 제어 소프트웨어 (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | 압력 펌프 제어, 흐름 조건 설정 및 흐름 시작 / 종료를위한 컴퓨터 소프트웨어 |
| 튜브 1.5 / 2.0 mL | Sarstedt | 72.706 / 72.695.500 | 항체 희석에 필요 |
| 50 mL의 반응 튜브 volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| RFP-expressing pneumococci | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | 게놈에 통합된 히스톤과 같은 단백질에 융합된 RFP를 발현하는 연쇄상구 |
| 청형 47 혈청학적 피펫 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | 대용량 |
| 파이핑용탄산나트륨 (Na2CO3, 물 없음) | Sigma Aldrich | 451614-25G | 100 mM 탄산나트륨 완충 |
| 인산이수소나트륨 (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | PBS 버퍼에 사용 |
| 스펙트럼 광도계 Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | 600nm에서 박테리아 현탁액의 광학 밀도(OD) 측정 |
| 차단 완충액 준비를 위한 | Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | PFA 고정 후 진핵 세포 투과화를 위해 dH20으로 희석된 0.1% 말단 농도에 사용 |
| 효모 추출물 | 옥소이드 | LP0021 | 박테리아는 1 % [w / w] 효모 추출물 = 완전한 박테리아 배양 배지 THY를 함유 한 THB 보충제에서 배양됩니다 |
참고문헌
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
- Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152
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재인쇄 및 허가
