Excroissance glomerulaire en tant qu’essai Ex Vivo pour analyser les voies impliquées dans l’activation des cellules épithéliales pariétales
Summary
Cet article décrit une méthode pour cultiver et analyser les excroissances épithéliales parétalaires glomertales des excroissances de globuleruli encapsulées isolées du rein de souris. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les voies impliquées dans la prolifération et la migration des cellules épithéliales pariétales.
Abstract
L’activation de la cellule épithéliale pariétale (PEC) est l’un des facteurs clés impliqués dans le développement et la progression de la glomerulosclérose. L’inhibition des voies impliquées dans l’activation épithéliale pariétale de cellules pourrait donc être un outil pour atténuer la progression des maladies glomerulaires. Cet article décrit une méthode pour la culture et l’analyse de l’excroissance épithéliale pariétale de glomeruli encapsulé isolé du rein de souris. Après avoir disséqué les reins isolés de souris, le tissu est haché, et les glomeruli sont isolés par tamisage. Glomeruli encapsulés sont recueillis, et le glomeruli simple sont cultivés pendant 6 jours pour obtenir l’excroissance glomerulaire des cellules épithéliales pariétales. Pendant cette période, la prolifération et la migration des cellules épithéliales pariétales peuvent être analysées en déterminant le nombre de cellules ou la surface des cellules qui dépassent. Ce test peut donc être utilisé comme un outil pour étudier les effets d’une expression génique altérée chez les souris transgéniques ou knock-out ou les effets des conditions de culture sur les caractéristiques de croissance et de signalisation des cellules épithéliales pariétales. En utilisant cette méthode, des voies importantes impliquées dans le processus d’activation des cellules épithéliales pariétales et par conséquent dans la glomerulosclérose peuvent être étudiées.
Introduction
Les maladies glomerulaires sont un groupe important de troubles rénaux et représentent une cause majeure de la maladie rénale terminale (ESRD). Malheureusement, les options de traitement spécifiques sont limitées et la progression vers l’ESRD est inévitable. Les maladies glomerulaires sont définies par la présence de lésions glomerulaires et peuvent être regroupées dans les maladies inflammatoires et non inflammatoires. Bien que l’insulte initiale soit différente, des études récentes ont montré qu’un mécanisme cellulaire commun conduit à l’hyperplasie épithéliale glomerulaire de cellules et finalement à la glomerulosclérose dans toutes les maladies glomerulaires, indépendamment de la cause sous-jacente1,2,3,4.
Plus précisément, il a été démontré que les lésions glomerulosclérotiques sont principalement composées de cellules épithéliales pariétales activées5,6. Dans des conditions physiologiques, les cellules épithéliales pariétales sont des cellules épithéliales plates qui tapissent la capsule du Glomerulus de Bowman. Cependant, toute lésion glomerulaire due à des mutations génétiques (p. ex., cytopathies spécifiques ou mitochondriales de podocyte), inflammation ou hyperfiltration (p. ex., causée par une masse rénale réduite, hypertension, obésité ou diabète sucré) peut déclencher l’activation des cellules épithéliales pariétales. Les cellules épithéliales pariétales activées prolifèrent et déposent la matrice extracellulaire qui entraîne la formation de croissants cellulaires ou de lésions sclérotiques5,7,8. La progression de ces processus entraîne la perte de la fonction rénale9. Par conséquent, l’activation des cellules épithéliales pariétales est un facteur clé dans le développement et la progression de la glomerulosclérose dans les maladies glomerulaires inflammatoires et non inflammatoires1,2,3,4,10.
Les processus moléculaires de médiation de l’activation des cellules épithéliales pariétales sont encore largement inconnus. Des études récentes montrent que les cellules épithéliales pariétales activées de novo express CD44, un récepteur qui est important pour l’activation de différentes voies impliquées dans la prolifération cellulaire et la migration. En outre, l’inhibition du CD44 a été montré pour inhiber l’activation épithéliale pariétale de cellules et atténuer la progression de la formation de croissant et de la glomerulosclérose dans les modèles animaux des maladies glomerulaires inflammatoires aussi bien que non-inflammatoires11,12.
Comme l’activation des cellules épithéliales pariétales est un acteur clé pour le développement de la glomerulosclérose et de la formation de croissants, l’inhibition de ces cellules pourrait ralentir la progression des maladies glomerulaires. L’élucidation des voies moléculaires conduisant l’activation épithéliale pariétale de cellules peut mener au développement des interventions thérapeutiques spécifiques qui atténuent la formation des lésions hyperplastiques et glomerulosclérotiques dans la maladie glomerular.
Dans les modèles animaux expérimentaux, il est souvent difficile de fournir des preuves d’un effet direct d’une expression génétique altérée (modèles knock-out ou modèles transgéniques de souris) ou d’un traitement médicamenteux sur les cellules épithéliales pariétales. Dans une souris knock-out conventionnelle, les changements in vivo observés pourraient s’expliquer par des changements directs dans les cellules épithéliales pariétales. Cependant, puisque l’expression du gène est également modifiée dans d’autres types de cellules à l’intérieur de la souris, on ne peut exclure les effets indirects médiés par d’autres types de cellules. Le développement de souris cré-lox conditionnelles entraînées par des promoteurs principalement actifs dans les cellules épithéliales pariétales a fourni une solution dans certains cas13. Néanmoins, les modèles transgéniques conditionnels sont complexes et bien que des lignes plus conditionnelles deviennent disponibles, pour bon nombre des lignes de souris conventionnelles knock-out ou transgéniques il n’y a pas encore de substitut conditionnel.
Pour étudier les effets directs sur les cellules épithéliales pariétales, notre groupe a développé un test ex vivo utilisant un seul glomeruli encapsulé isolé des reins de souris pour mesurer et analyser la prolifération et la migration des cellules épithéliales pariétales. Cette méthode nous permettra de déterminer les effets spécifiques aux cellules épithéliales pariétales et de trouver des voies responsables pour l’activation des cellules épithéliales pariétales et les options de traitement d’essai pour inhiber cette activation.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant le protocole décrit dans cet article, on peut utiliser le glomeruli encapsulé unique pour évaluer la prolifération de cellules épithéliales pariétales qui est une conséquence de l’activation de cellules épithéliales pariétales. Ce modèle ex vivo nous permettra d’étudier en détail les voies moléculaires, qui sont impliquées dans l’activation des cellules épithéliales pariétales. La méthode décrite s’appuie sur le concept simple de dissection rénale et de tamisage pour isoler et c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par la Fondation néerlandaise du rein (subvention 14A3D104) et l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (subvention NWO VIDI: 016.156.363).
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
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