קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול יציב כדי לכמת 40 תרכובות מעורב מטבוליזם פחמן מרכזי ואנרגיה בתגובות סינתזה של חלבון-ללא תא. תערובת הסינתזה התאית היא ללעג עם אנילין להפרדה אפקטיבית באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשלב היפוך, ולאחר מכן כימות על-ידי ספקטרומטר מסה באמצעות מisotopically מתויג בתקנים פנימיים.
Abstract
סינתזה של חלבון תא (CFPS) היא טכנולוגיה מתפתחים במערכות ובביולוגיה סינתטית לייצור מתורבת של חלבונים. עם זאת, אם CFPS הולך לנוע מעבר למעבדה ולהיות מקובל וסטנדרטי רק בטכנולוגיית ייצור הזמן, אנחנו חייבים להבין את גבולות הביצועים של מערכות אלה. לקראת שאלה זו, פיתחנו פרוטוקול חזק כדי לכמת 40 תרכובות מעורבים גליקוליזיס, מסלול פוספט פנטוז מחזור חומצה tricarboxylic מטבוליזם אנרגיה התחדשות קופקטור ב-cfps תגובות. השיטה משתמשת בתקנים פנימיים המתויגים עם 13ג-אנילין, ואילו תרכובות במדגם הן ללעג עם 12ג-אנילין. הסטנדרטים הפנימיים והמדגם היו מעורבים ונותחו על-ידי כרומטוגרפיה ברמה הפוכה-ספקטרומטריה (LC/MS). שיתוף של תרכובות הדיכוי יון מסולק, המאפשר כימות מדויקת של ריכוזי מטבוליט מעל 2-3 הזמנות של גודל שבו מקדם המתאם הממוצע היה 0.988. חמישה מתוך 40 תרכובות לא היו מתוייגות עם אנילין, עם זאת, הם עדיין זוהו במדגם CFPS וכימות עם שיטת עקומה סטנדרטית. לרוץ כרומטוגרפי לוקח בערך 10 דקות להשלים. יחד, פיתחנו מהיר, שיטה איתנה כדי להפריד ומדויק לכמת 40 תרכובות מעורבות CFPS בריצה LC/MS אחת. השיטה היא גישה מקיפה ומדויקת לאפיון חילוף חומרים ללא תא, כך שבסופו של דבר, אנו יכולים להבין ולשפר את התשואה, הפרודוקטיביות ויעילות האנרגיה של מערכות ללא תא.
Introduction
סינתזה של חלבון תא (CFPS) היא פלטפורמה מבטיחה עבור ייצור של חלבונים וכימיקלים, יישום שהיה שמור באופן מסורתי עבור תאים חיים. מערכות ללא תא נגזרות מתמציות תאים גולמי ומבטלות את הסיבוכים המשויכים לצמיחת התאים1. בנוסף, CFPS מאפשר גישה ישירה מטבוליטים ומכונות ביו סינתטי ללא הפרעה של קיר התא. עם זאת, חסרה הבנה בסיסית של מגבלות הביצועים של תהליכים ללא תא. שיטות תפוקה גבוהה עבור הקוונט מטבוליזם הם יקרי ערך לאפיון של חילוף החומרים והם קריטיים לבניית מודלים מטבולית חישובית2,3,4. שיטות נפוצות המשמשות לקביעת ריכוזי מטבוליט כוללות תהודה מגנטית גרעינית (nmr), התמרת פורייה-ספקטרוסקופיית אינפרא אדום (FT-IR), assays מבוסס אנזימים, וספקטרומטר המסה (MS)5,6,7 ,8. עם זאת, שיטות אלה מוגבלות לעתים קרובות על ידי חוסר היכולת שלהם למדוד ביעילות תרכובות מרובות בבת אחת ולעתים קרובות דורשים גודל מדגם גדול יותר מאשר התגובות הרגילות ללא תא. לדוגמה, בחני המבוססת על אנזימים יכולים לעתים קרובות לשמש רק כדי לכמת מתחם אחד בהפעלה, ומוגבלים כאשר גודל המדגם קטן, כגון תגובות סינתזה של חלבון תא (בדרך כלל הפעלה בקנה מידה של 10-15 μl). בינתיים, NMR דורש שפע רב של מטבוליטים לאיתור וכימות הכמת5. לגבי חסרונות אלה, שיטות כרומטוגרפיה במשולב עם ספקטרומטר מסה (LC/MS) מספקות מספר יתרונות, כולל רגישות גבוהה ויכולת למדוד מינים מרובים בו9; עם זאת, המורכבות האנליטית גדלה במידה ניכרת עם המספר והמגוון של המינים הנמדדים. לפיכך, חשוב לפתח שיטות הממש את פוטנציאל התפוקה הגבוהה של מערכות LC/MS. תרכובות במדגם מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית מזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. האות של המתחם תלוי הריכוז שלה ויעילות האינון, שבו האינון יכול להשתנות בין תרכובות יכול להיות גם תלוי במטריצה לדוגמה.
השגת אותו יעילות אינון בין המדגם והתקנים הוא אתגר בעת שימוש LC/MS לכמת מנתחי. עוד, הקוונפיקציה הופכת מאתגרת יותר עם גיוון מטבוליט בשל פיצול האות ו טרוגניות באהדה פרוטון וקוטביות10. לבסוף, מטריצת שיתוף הפעולה של המדגם יכול גם להשפיע על היעילות יינון של תרכובות. כדי לטפל בנושאים אלה, מטבוליטים יכול להיות לריקי כימית, להגדיל את הרזולוציה ואת הרגישות של מערכות LC/MS, ובמקביל להקטין את האות פיצול במקרים מסוימים10,11. העבודה הכימית עובד על ידי תיוג קבוצות פונקציונליות ספציפיות של מטבוליטים כדי לכוונן את המאפיינים הפיזיים שלהם כמו תשלום או hydrophobicity כדי להגדיל את יעילות יינון11. סוכני תיוג שונים יכולים לשמש כדי למקד קבוצות פונקציונליות שונות (למשל, amines, הידרוקסילס, פוספטים, חומצות קרבוקסילית וכו ‘). אנילין, אחד הסוכנים האלה ללעג, מטרות קבוצות פונקציונליות מרובות בבת אחת, ומוסיף רכיב הידרופובי למולקולות הידרופילית, ובכך מגדיל את רזולוציית ההפרדה שלהם ואת האות12. כדי לטפל באפקט הדיכוי המיני-מטריצות של המטריצה, יאנג ועמיתים פיתחו טכניקה המבוססת על התווית הפנימית של התקן הפנימי (GSIST) לתיוג שבו התקנים מתויגים עם 13ג אנילין איזוטופים ומעורבב עם המדגם 12,13. החומרים הפנימיים של המטאווליט והתקן הפנימי הם בעלי היעילות האינון מאז שהם שותפים, ויחס האינטנסיביות שלהם יכול לשמש לכמת את הריכוז במדגם הניסיוני.
במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול לזהות ולכמת 40 תרכובות מעורבים גליקוליזיס, מסלול פוספט פנטוז מחזור חומצה tricarboxylic מטבוליזם אנרגיה התחדשות קופקטור ב-cfps תגובות. השיטה מבוססת על הגישה GSIST, שבו השתמשנו 12ג-אנילין ו -13ג-אנילין לתייג, לזהות, ולכמת מטבוליטים באמצעות היפוך-שלב LC/MS. הטווח הליניארי של כל התרכובות המקיפות 2-3 הזמנות של סדר גודל עם מקדם מתאם ממוצע של 0.988. לכן, השיטה היא גישה איתנה ומדויקת לחקור חילוף חומרים ללא תא, ואולי תמציות תאים שלמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכות ללא תא יש קיר תא, ולכן יש גישה ישירה מטבוליטים ומכונות ביו סינתטי ללא צורך הכנה לדוגמה מורכבת. עם זאת, מעט מאוד עבודה נעשתה כדי לפתח פרוטוקולים יסודיים וחזקים כדי כימות לחקור מערכות התגובה של התא ללא. במחקר זה, פיתחנו מהיר, שיטה איתנה כדי לכמת מטבוליטים בתערובות התגובה של התא חינם, פו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה שתוארה נתמכת על ידי המרכז על הפיסיקה של מטבוליזם הסרטן באמצעות הפרס מספר 1U54CA210184-01 מהמכון הלאומי לסרטן (https://www.cancer.gov/). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או המכונים הלאומיים לבריאות. לתורמים לא היה כל תפקיד בתכנון לימוד, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
