Абсолютная количественная количественная количественная количественная метания белка без клеток путем обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии
Summary
Здесь мы представляем надежный протокол для количественной оценки 40 соединений, участвующих в центральном метаболизме углерода и энергии в реакции синтеза белка без клеток. Смесь синтеза без клеток производная с анилином для эффективного разделения с использованием обратной фазы жидкой хроматографии, а затем количественно масс-спектрометрии с использованием изотопно обозначенных внутренних стандартов.
Abstract
Синтез белка без клеток (CFPS) является новой технологией в системах и синтетической биологии для производства белков in vitro. Однако, если CFPS собирается выйти за пределы лаборатории и стать широко распространенной и стандартной как раз вовремя технологии производства, мы должны понимать пределы производительности этих систем. На этот вопрос мы разработали надежный протокол для количественной оценки 40 соединений, участвующих в гликолизе, пентоза фосфата пути, трикарбоксиловая кислота цикла, метаболизм энергии и кофактор регенерации в CFPS реакций. Метод использует внутренние стандарты, отмеченные 13C-анилин, в то время как соединения в образце производные с 12C-анилин. Внутренние стандарты и образец были смешаны и проанализированы с помощью обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC/MS). Со-элютация соединений устранила подавление иона, позволив точно количественно определить концентрацию метаболитов на 2-3 порядка, где средний коэффициент корреляции составлял 0,988. Пять из сорока соединений были не отмечены анилином, однако они все еще были обнаружены в образце CFPS и количественно с помощью стандартного метода кривой. Хроматографический пробег занимает около 10 минут. В совокупности мы разработали быстрый и надежный метод разделения и точной количественной оценки 40 соединений, участвующих в CFPS в одном запуске LC/MS. Этот метод представляет собой комплексный и точный подход к характеристике метаболизма без клеток, так что в конечном счете, мы можем понять и улучшить урожайность, производительность и энергоэффективность систем, свободных от клеток.
Introduction
Синтез белка без клеток (CFPS) является перспективной платформой для производства белков и химических веществ, приложение, которое традиционно зарезервировано для живых клеток. Системы, свободные от клеток, получены из экстрактов сырой клетки и устраняют осложнения, связанные с ростом клеток1. Кроме того, CFPS обеспечивает прямой доступ к метаболитам и биосинтетическому оборудованию без вмешательства клеточной стенки. Однако фундаментальное понимание пределов производительности процессов, свободных от клеток, отсутствует. Высокопроизводительные методы метаболитной количественной оценки имеют важное значение для характеристики метаболизма и имеют решающее значение для построения метаболических вычислительных моделей2,3,4. Общие методы, используемые для определения концентрации метаболита включают ядерный магнитный резонанс (NMR), Фурье трансинфракрасной спектроскопии (FT-IR), ферментнаосновения и масс-спектрометрии (MS)5,6,7 ,8. Однако эти методы часто ограничиваются их неспособностью эффективно измерять несколько соединений одновременно и часто требуют размера выборки, превышающее типичные реакции, свободные от клеток. Например, анализы на основе ферментов часто могут использоваться только для количественной оценки одного соединения в пробеге, и ограничены, когда размер выборки мал, например, в реакции синтеза белка без клеток (обычно работают по шкале 10-15 л). Между тем, ЯМР требует высокого изобилия метаболитов для обнаружения и количественной оценки5. К этим недостаткам, методы хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией (LC/MS) обеспечивают несколько преимуществ, включая высокую чувствительность и возможность измерения нескольких видов одновременно9; однако сложность аналитических исследований значительно возрастает по мере измерения количества и разнообразия видов. Поэтому важно разработать методы, которые в полной мере реализуют высокопроизводительный потенциал систем LC/MS. Соединения в образце разделены жидкой хроматографией и идентифицируются с помощью масс-спектрометрии. Сигнал соединения зависит от его концентрации и эффективности ионизации, где ионизация может варьироваться между соединениями, а также может зависеть от матрицы образца.
Достижение той же эффективности ионизации между образцом и стандартами является сложной задачей при использовании LC/MS для количественной оценки анализов. Кроме того, количественная оценка становится все более сложной задачей с метаболитным разнообразием из-за расщепления сигналов и неоднородности в сродстве протона и полярности10. Наконец, матрица совместного использования образца может также влиять на эффективность ионизации соединений. Для решения этих проблем метаболиты могут быть химически производными, увеличивая разрешение разделения и чувствительность систем LC/MS, одновременно уменьшая расщепление сигнала в некоторых случаях10,11. Химическая произвена работает путем пометки конкретных функциональных групп метаболитов, чтобы настроить их физические свойства, такие как заряд или гидрофобность для повышения эффективности ионизации11. Различные метки могут быть использованы для целевых различных функциональных групп (например, амины, гидроксилы, фосфаты, карбоксиловая кислоты и т.д.). Анилин, один из таких агентов производной, цели нескольких функциональных групп одновременно, и добавляет гидрофобный компонент в гидрофильных молекул, тем самым увеличивая их разделение резолюции исигнал12. Для решения эффекта подавления ко-элюлинга матрицы Ян и его коллеги разработали методику, основанную на маркировке групповых специфических внутренних стандартных технологий (GSIST), где стандарты маркируются 13-c-изотопов анилина и смешиваются с образцом 12,13. Метаболит и соответствующий внутренний стандарт имеют одинаковую эффективность ионизации, поскольку они совместно элютируются, и коэффициент их интенсивности может быть использован для количественной оценки концентрации в экспериментальной выборке.
В этом исследовании мы разработали протокол для обнаружения и количественной оценки 40 соединений, участвующих в гликолизе, пентоза фосфатпуть, трикарбоксиловая кислота цикла, метаболизм энергии и кофактор регенерации в CFPS реакций. Метод основан на подходе GSIST, где мы использовали 12C-анилин и 13C-анилин для тегов, обнаружения и количественной оценки метаболитов с помощью обратной фазы LC/MS. Линейный диапазон всех соединений охватывал 2-3 порядка величины со средним коэффициентом корреляции 0,988. Таким образом, метод является надежным и точным подходом к допросу клеточного метаболизма, и, возможно, цельноклеточных экстрактов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Системы, свободные от клеток, не имеют клеточной стенки, поэтому существует прямой доступ к метаболитам и биосинтетическому оборудованию без необходимости сложной подготовки образцов. Тем не менее, было проделано очень мало работы по разработке тщательных и надежных протоколов для ко…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Описанная работа была поддержана Центром по физике метаболизма рака через премию Номер 1U54CA210184-01 от Национального института рака (https://www.cancer.gov/). Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национального института рака или Национальных институтов здравоохранения. Спонсоры не принимали никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
