Absolut kvantifiering av cellfri protein syntes metabolism genom omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri
Summary
Här presenterar vi ett robust protokoll för att kvantifiera 40 föreningar som är involverade i Central kol-och energimetabolism i cell fria proteinsyntes reaktioner. Den cell fria syntes blandningen är derivatiserad med anilin för effektiv separation med hjälp av omvänd fas vätskekromatografi och sedan kvantifieras med masspektrometri med isotopiskt märkta interna standarder.
Abstract
Cell fri proteinsyntes (CFPS) är en framväxande teknik i system och syntetisk biologi för in vitro-produktion av proteiner. Men om CFPS kommer att gå bortom laboratoriet och bli en utbredd och standard just i tid tillverkningsteknik, måste vi förstå Prestandagränser för dessa system. Mot denna fråga utvecklade vi ett robust protokoll för att kvantifiera 40 föreningar som deltar i glykolys, pentos fosfat vägen, trikarboxylsyra cykeln, energimetabolism och kofaktor förnyelse i CFPS reaktioner. Metoden använder interna standarder märkta med 13c-Aniline, medan föreningar i provet är derivatized med 12c-anilin. De interna standarderna och provet blandades och analyserades av omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri (LC/MS). Co-elueringen av föreningar elimineras Jon dämpning, vilket möjliggör korrekt kvantifiering av metabolitkoncentrationer över 2-3 storleksordningar där den genomsnittliga korrelationskoefficienten var 0,988. Fem av de 40 föreningarna var omärkta med anilin, men de upptäcktes fortfarande i CFPS provet och kvantifierades med en standardkurva metod. Den kromatografiska körningen tar ca 10 min att färdigställa. Sammantaget har vi utvecklat en snabb, robust metod för att separera och korrekt kvantifiera 40 föreningar inblandade i CFPS i en enda LC/MS Run. Metoden är en heltäckande och noggrann metod för att karakterisera cellfri metabolism, så att vi i slutändan kan förstå och förbättra utbytet, produktiviteten och energieffektiviteten i cell fria system.
Introduction
Cell fri proteinsyntes (CFPS) är en lovande plattform för tillverkning av proteiner och kemikalier, en applikation som traditionellt har reserverats för levande celler. Cell-fria system härrör från rå cell extrakt och eliminera komplikationer i samband med celltillväxt1. Dessutom möjliggör CFPS direkttillgång till metaboliter och biosyntetiska maskiner utan inblandning av en cellvägg. Men en grundläggande förståelse för Prestandagränser för cell-fria processer har saknats. Metoder med högt dataflöde för kvantifiering av metaboliten är värdefulla för karakterisering av metabolism och är avgörande för byggandet av metaboliska beräkningsmodeller2,3,4. Vanliga metoder som används för att bestämma metabolismkoncentrationer inkluderar kärnmagnetisk resonans (NMR), Fouriertransform-infraröd spektroskopi (ft-IR), enzymbaserade analyser och masspektrometri (MS)5,6,7 ,8. Emellertid, dessa metoder är ofta begränsade av deras oförmåga att effektivt mäta flera föreningar på en gång och kräver ofta en urvalsstorlek större än typiska cell fria reaktioner. Till exempel kan enzym-baserade analyser ofta endast användas för att kvantifiera en enda förening i en körning, och är begränsade när Urvalsstorleken är liten, till exempel i cell fria proteinsyntes reaktioner (vanligtvis körs på en 10-15 μL skala). Samtidigt kräver NMR ett högt överflöd av metaboliter för detektion och kvantifiering5. Mot dessa brister ger kromatografimetoder tillsammans med masspektrometri (LC/MS) flera fördelar, bland annat hög känslighet och förmåga att mäta flera arter samtidigt9; den analytiska komplexiteten ökar dock avsevärt med antalet och mångfalden av de arter som mäts. Det är därför viktigt att utveckla metoder som till fullo inser potentialen för hög kapacitet i LC/MS-system. Föreningar i ett prov separeras med vätskekromatografi och identifieras genom masspektrometri. Signalen av föreningen beror på dess koncentration och jonisering effektivitet, där jonisering kan variera mellan föreningar och kan också bero på provet matrisen.
Att uppnå samma joniseringseffektivitet mellan provet och standarderna är en utmaning när man använder LC/MS för att kvantifiera analyter. Ytterligare, kvantifiering blir mer utmanande med metabolit mångfald på grund av signal uppdelning och heterogenitet i Proton samhörighet och polaritet10. Slutligen kan Co-eluting matris av provet också påverka jonisering effektivitetsvinster av föreningarna. För att lösa dessa problem, metaboliter kan vara kemiskt derivatized, öka separation upplösning och känslighet av LC/MS-system, samtidigt minska signalen uppdelning i vissa fall10,11. Kemisk derivatisering fungerar genom att tagga specifika funktionella grupper av metaboliter för att justera deras fysiska egenskaper som laddning eller vattenavvisande egenskaper att öka jonisering effektivitet11. Olika märknings agenter kan användas för att rikta olika funktionella grupper (t. ex. aminer, hydroxyls, fosfater, karboxylsyror, etc.). Aniline, en sådan derivatisering agent, riktar flera funktionella grupper på en gång, och lägger till en hydrofoba komponent i hydrofila molekyler, vilket ökar deras separation upplösning och signal12. För att ta itu med co-eluting Matrix Ion suppression effekt, Yang och medarbetare utvecklat en teknik som bygger på gruppspecifika intern standard Technology (gsist) märkning där standarder är märkta med 13C anilin isotoper och blandas med provet 12,13. Metaboliten och motsvarande interna standard har samma joniseringseffektivitet eftersom de Co-elute, och deras intensitet förhållandet kan användas för att kvantifiera koncentrationen i det experimentella provet.
I denna studie, vi utvecklat ett protokoll för att upptäcka och kvantifiera 40 föreningar som deltar i glykolys, den pentos fosfat vägen, den trikarboxylsyracykeln Acid cykel, energimetabolism och kofaktor förnyelse i CFPS reaktioner. Metoden bygger på GSIST-metoden, där vi använde 12c-anilin och 13c-anilin för att tagga, detektera och kvantifiera metaboliter med hjälp av omvänd fas LC/MS. Det linjära sortimentet av alla föreningar sträckte 2-3 storleksordningar med en genomsnittlig korrelationskoefficient på 0,988. Således är metoden en robust och noggrann metod för att förhöra cellfri metabolism, och möjligen hel cells extrakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell fria system har ingen cellvägg, vilket innebär att det finns direkttillgång till metaboliter och biosyntetiska maskiner utan behov av komplext provberedning. Men mycket lite arbete har gjorts för att utveckla noggranna och robusta protokoll för att kvantitativt förhöra cell-Free reaktionssystem. I denna studie utvecklade vi en snabb och robust metod för att kvantifiera metaboliter i cell fria reaktionsblandningar och potentiellt i hel cells extrakt. Individuell kvantifiering av metaboliter i komplexa blandni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det arbete som beskrivs stöddes av centrum för fysiken i cancer metabolism genom tilldelning nummer 1U54CA210184-01 från National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/). Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella synen på National Cancer Institute eller National Institutes of Health. Finansiärer hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
