عزل ميكروليا الخاصة بالمنطقة من واحد الكبار الفار الدماغ نصف الكره لعمق خليه واحده التسلسل RNA
Summary
نحن نقدم بروتوكولا لعزل الخلايا الصغيرة من المناطق تشريح مختلفه من نصف الكره الدماغ الفار الكبار ، تليها اعداد المكتبة شبه المؤتمتة لعمق خليه واحده الحمض الريبي النيبالي تسلسل كامل طول الكتابات النصية. ستساعد هذه الطريقة علي توضيح التغاير الوظيفي للدبقيه الصغيرة في الصحة والمرض.
Abstract
كما الضامة المقيمين في الجهاز العصبي المركزي ، الميكروبات الصغيرة بنشاط السيطرة علي نمو الدماغ والتوازن ، واختلالاتها قد تدفع الامراض البشرية. وقد أحرز تقدم كبير للكشف عن التواقيع الجزيئية من الخلايا الصغيرة الساكنة ، فضلا عن التغييرات في التعبير الجيني لديها استجابه للمؤثرات البيئية. مع ظهور ونضوج المنهجيات الجينية أحاديه الخلية ، فانه من المسلم به بشكل متزايد ان غير متجانس الصغيرة قد تكمن وراء الأدوار المتنوعة التي تلعبها في الظروف التنموية والمرضية المختلفة. ويمكن تحقيق مزيد من التشريح لهذا التغاير من خلال العزل الفعال للخلايا الصغيرة من منطقه معينه من الاهتمام ، يليه التنميط الحساس لكل خليه. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول مفصل للعزل السريع من الخلايا الصغيرة من مناطق الدماغ المختلفة في نصف الكره الدماغية الماوس الكبار واحد. ونحن أيضا شرح كيفيه استخدام هذه الخلايا الصغيرة فرزها لتسلسل المستندة إلى لوحه عميقة الحمض الريبي النيبالي. ونناقش قابليه هذه الطريقة للتكيف مع سيناريوهات أخرى ونقدم مبادئ توجيهيه لتحسين النظام لاستيعاب الدراسات الواسعة النطاق.
Introduction
الأجزاء الصغيرة التي تمثل 5% − 10% من جميع الخلايا العصبية هي الضامة المقيمة المنتشرة في جميع انحاء الجهاز العصبي المركزي (CNS)1. المحمية وراء حاجز الدم في الدماغ, الميكروبات النموذجية في الدماغ الكبار صحية تحتوي علي العديد من العمليات الدقيقة التي تمتد بسرعة والتراجع للتفاعل مع الخلايا العصبية وغيرها من الكريات الدبقيه في parenchyma. ويمكن أيضا ان تعتمد الخلايا الصغيرة المورفولوجية الشكل الأميبا المرتبطة بزيادة وظيفة البالعة خلال مراحل تنموية محدده أو عند التحديات المناعية في الإصابات والامراض1،2،3،4. كما يتم توضيح المزيد من وظائف الخلايا الصغيرة الصغرى ، ويغذي الاثاره أكثر من الدراسات علم الوراثة البشرية ، والتي أظهرت ان العديد من الجينات خطر الامراض العصبية ، مثل TREM2 ، هي في الغالب أو حصرا التي أعرب عنها ميكروليا5،6،7. نظرا لأهميتها في التنمية والأدوار المعقولة القيادة المرض, وقد تم مؤخرا بذل جهد هائل نحو فهمنا لتنظيم الجينات ميكروجليال ووظيفة في الأمل في العثور علي أهداف علاجيه جديده للامراض التنكسية العصبية1,8.
ويسمح تسلسل الحمض الريبي النيبالي (RNA-seq) بتوصيف غير متحيز للتعبير الجيني الخاص بنوع الخلية ، والذي بدوره يرشد العلماء إلى التحقيق في وظائف الجينات في الشبكات الخلوية الكثيفة7. وقد تم الحمض الريبي النيبالي-seq في الغالب علي عينات السائبة ، مما يؤدي إلى اكتشاف التوقيع الجينات ميكروجليال التماثل الذي يميزها عن الخلايا العصبية والمناعية الأخرى9. ومع ذلك ، يمكن ان يغفل هذا النهج الاختلافات الجزيئية والوظيفية بين الخلايا الصغيرة ، وخاصه تلك الموجودة بشكل عابر في التنمية ، أو المرتبطة بالشيخوخة والمرض. وفي الواقع ، فان الخلية الواحدة RNA-seq (scrna-seq) تقدم الحساسية والدقة التي أحدثت ثوره في المجال من خلال الكشف عن عدم التجانس في السابق من الميكروبات الصغيرة في مجموعه متنوعة من السياقات2،3،10. الاضافه إلى ذلك ، ونظرا لوجود خلايا مناعية مماثله أخرى في واجهه الجهاز العصبي الدوران ، يوفر scRNA-seq معلومات تساعد علي تصميم أدوات جديده لفصل وتشريح وظيفيا هذه الخلايا ذات الصلة مع القليل من المعرفة السابقة2،11.
وقد تم اختراع مجموعه متنوعة من المنصات التي تليها scRNA ، كل مناسبه لتطبيقات معينه12. وبصفه عامه ، فان الطرق القائمة علي القطرات ، مثل الجينوم الجيني 10x ، تكون اعلي في الانتاجيه مع (عشرات) آلاف الخلايا المتسلسلة في كل شوط ، وهي اقل انتقائية للمدخلات التي قد تحتوي علي مجموعات مختلطة من الخلايا التي تتطلب تصنيفا واسعا. توفر الطرق المستندة إلى اللوحة حساسية اعلي وقراءه العمق13،14، وعاده ما تستهدف الفئات السكانية المحددة من فرز الخلايا للكشف عن الاختلافات الدقيقة أو النصوص النادرة.
هنا ، ونحن نقدم تفاصيل حول كيفيه عزل الخلايا الصغيرة من مناطق مختلفه من الدماغ الماوس تشريح من نصف الكره الواحد ، والتي تستخدم لخليه واحده (أو السائبة) الحمض الريبي النيبالي-seq بعد اجراء شبه الألى لوحه القائمة علي التحضير للمكتبة. ويمكن بعد ذلك استخدام نصف الكره الآخر للتحقق من صحة الانسجه. تبسيط من الطريقة المنشورة سابقا9، ويهدف هذا البروتوكول العزلة لتعظيم العائد من كميه صغيره من مواد البداية ، وفي الوقت نفسه الحفاظ علي ملامح التعبير الجيني ميكروجليال الذاتية. نستخدم الفرز الخلوي المنشط (FACS) لإثراء الأجزاء الصغيرة (أو الخلايا المناعية الأخرى ذات الاهتمام) في لوحات 96 وتصغير احجام الكواشف لاعداد المكتبة من أجل زيادة الانتاجيه. ونحن نسلط الضوء علي هذه المنصة الحساسة ، علي الرغم من انه يمكن تطبيق استراتيجيات أخرى قائمه علي اللوحات. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهوله لعزل الخلايا الصغيرة من الانسجه الأخرى التي تم تشريحها ، مثل الاصابه أو بؤر المرض ، ويمكن ان يختلف عمر الماوس عبر اي مراحل ما بعد الولادة تقريبا. ومن شان العزل الفعال للخلايا الصغيرة الاقليميه للدراسات الناسخة أحاديه الخلية ان يسهل الفهم الأفضل لوظائفهم في مجال الصحة والمرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
الميكروبات تتفاعل بنشاط مع أنواع الخلايا الأخرى في الوحدة العصبية الخاصة ، وانها حساسة جدا للمؤثرات البيئية. من أجل التقليل من الاستجابات التهابيه والتغيرات الشاذة في التعبير الجيني اثناء عمليه العزل ، تم تبسيط هذا البروتوكول من الطريقة9المنشورة سابقا ، وهو الآن مناسب لعزل …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ماريكو ل. بينيت ، ليانا نيكول بونانو ، و سبيروس دارمانيس لمساعدتهم خلال تطوير هذا البروتوكول. ونشكر أيضا المرفق المشترك لمؤسسه “ستانفورد” ، ولا سيما ميريديث وايغلارز وليزا نيكولز ؛ ين تران ، مايكل Eckart من البروتين ستانفورد ومرفق الحمض النووي (PAN) لدعمهم الكبير للتصوير. ويتم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسه JPB ومؤسسه فنسنت j. Coates.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
- Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
- Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
- Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer’s disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
- Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), 79-89 (2018).
