Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing
Summary
We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.
Abstract
Als Resident macrofagen in het centrale zenuwstelsel, Microglia actief controle van de ontwikkeling van de hersenen en homeostase, en hun disfuncties kunnen menselijke ziekten stimuleren. Er zijn aanzienlijke vooruitgang geboekt om de moleculaire handtekeningen van homeostatische Microglia en veranderingen van hun genexpressie te onthullen in reactie op milieu stimuli. Met de opkomst en rijping van eencellige genomische methodologieën wordt steeds meer erkend dat heterogene Microglia de verschillende rollen kan onderdoen die ze spelen in verschillende ontwikkelings-en pathologische omstandigheden. Verdere dissectie van dergelijke heterogeniteit kan worden bereikt door efficiënte isolatie van Microglia uit een bepaald gebied van belang, gevolgd door een gevoelige profilering van individuele cellen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de snelle isolatie van Microglia uit verschillende hersengebieden in een enkele volwassen muis hersen hemisfeer. We laten ook zien hoe je deze gesorteerde Microglia gebruikt voor op platen gebaseerde Deep single-cell RNA-sequencing. We bespreken het aanpassingsvermogen van deze methode voor andere scenario’s en bieden richtlijnen voor het verbeteren van het systeem voor grootschalige studies.
Introduction
Microglia, dat 5% − 10% van alle neurale cellen vertegenwoordigt, zijn ingezeten macrofagen verspreid over het centrale zenuwstelsel (CNS)1. Beschermd achter de bloed-hersen barrière, typische Microglia in een gezonde volwassen hersenen bevatten vele fijne processen die snel uitbreiden en intrekken om te communiceren met neuronen en andere gliacellen in het parenchym. Microglia kan ook de amoeboïde morfologie aannemen die gepaard gaat met een verhoogde fagocytische functie tijdens specifieke ontwikkelingsstadia of bij immuunproblemen bij letsel en ziekte1,2,3,4. Recente spannende ontdekkingen hebben duidelijk aangetoond dat Microglia geenszins passieve omstanders zijn van hersenen-afgeleide of pathologische signalen, maar spelen cruciale rollen bij het beheersen van de hersenontwikkeling en homeostase, bijvoorbeeld door neuronale overleving te ondersteunen, onrijpe synapsen te snoeien, het bevorderen van oligodendrocyten Lineage cellen differentiatie evenals angiogenese1. Naarmate er meer functies van Microglia worden opgehelderd, wordt de opwinding verder gevoed door onderzoek naar menselijke genetica, waaruit bleek dat veel neurodegeneratieve ziektebestrijdings genen, zoals TREM2, overwegend of uitsluitend worden uitgedrukt door Microglia5,6,7. Gezien hun betekenis in de ontwikkeling en de plausibele rol van de ziekte, is er recentelijk een enorme inspanning geleverd naar ons begrip van microglial genregulatie en-functie in de hoop nieuwe therapeutische doelstellingen voor neurodegeneratieve ziekten van1,8te vinden.
RNA-sequencing (RNA-SEQ) maakt onbevooroordeelde karakterisatie van celtypespecifieke genexpressie mogelijk, die op zijn beurt wetenschappers begeleidt om genfuncties in dichte cellulaire netwerken7te onderzoeken. RNA-SEQ was grotendeels gedaan op bulk monsters, wat leidde tot de ontdekking van een homeostatische microglial gen Signature die hen onderscheidt van andere neurale en immune cellen9. Echter, een dergelijke aanpak kan over het hoofd zien moleculaire en functionele verschillen tussen Microglia, vooral die transitief aanwezig zijn in ontwikkeling, of geassocieerd met veroudering en ziekte. Inderdaad, single-cell RNA-SEQ (scrna-SEQ) biedt de gevoeligheid en resolutie die het veld hebben veranderd door het onthullen van eerder ondergewaardeerde heterogeniteit van Microglia in een verscheidenheid van contexten2,3,10. Bovendien, vanwege de aanwezigheid van andere soortgelijke immuuncellen op de CNS-circulatie-interface, biedt scRNA-SEQ informatie die het ontwerp van nieuwe instrumenten helpt om deze gerelateerde cellen te scheiden en functioneel te ontleden met weinig voorkennis2,11.
Een divers aanbod van scRNA-SEQ platformen zijn uitgevonden, elk geschikt voor bepaalde toepassingen12. In het algemeen zijn op droplet gebaseerde methoden, zoals 10x Genomics, hoger in doorvoer met (tientallen) duizenden cellen die in elke uitvoering worden gesequentieerd, en ze zijn minder selectief voor de invoer die gemengde celpopulaties kan bevatten die een brede categorisatie vereisen. Op plaat gebaseerde methoden bieden een hogere gevoeligheid en lees diepte13,14, meestal gericht op specifieke populaties van celsortering om subtiele verschillen of zeldzame transcripten te onthullen. Gezien het kleine percentage microglial cellen, met name die ontwikkelings-of ziektegebonden subpopulaties, is het vaak wenselijk om Microglia te isoleren van een specifieke regio van belang en diepe en volledige transcriptomische informatie te verkrijgen om hun heterogeniteit te begrijpen.
Hier geven we informatie over hoe Microglia te isoleren van verschillende muizen hersengebieden die worden ontleed van een enkele halve bol, die worden gebruikt voor eencellige (of bulk) RNA-SEQ na een semi-geautomatiseerde plaat-gebaseerde bibliotheek voorbereidingsprocedure. De andere halve bol kan vervolgens worden gebruikt voor histologische validatie. Gestroomlijnd vanaf een eerder gepubliceerde methode9, is dit isolatie protocol bedoeld om de opbrengst van kleine hoeveelheid start materialen te maximaliseren en ondertussen endogene microglial genexpressie profielen te onderhouden. We gebruiken fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om Microglia (of andere gerelateerde immuuncellen van belang) te verrijken in 96-well Plates en miniaturiseren de volumes van reagentia voor bibliotheek voorbereiding om de doorvoer te verhogen. We belichten dit gevoelige scRNA-SEQ-platform, hoewel andere op platen gebaseerde strategieën kunnen worden toegepast. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast om Microglia te isoleren van andere ontleed weefsels, zoals letsel of ziekte Foci, en de leeftijd van de muis kan variëren in bijna elke postnatale fase. Efficiënt isoleren van regionale Microglia voor onderzoeken met één cel transcriptomics zal een beter begrip van hun functies in gezondheid en ziekte vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia actief interactie met andere celtypen in het CZS, en ze zijn zeer gevoelig voor milieu stimuli. Om ontstekingsreacties en afwijkende veranderingen in hun genexpressie tijdens het isolatie proces te minimaliseren, is dit protocol gestroomlijnd vanuit een eerder gepubliceerde methode9, en het is nu geschikt om Microglia te isoleren van meerdere regio’s van een enkele muis hersenhelft parallel. De weefsels en reagentia worden op koude temperatuur gehouden en experimenten worden tijdig uitge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno en Spyros Darmanis voor hun hulp bij de ontwikkeling van dit protocol. We bedanken ook de gedeelde FACS-faciliteit van Stanford, met name Meredith Weglarz en Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart van Stanford protein en Nucleic Acid Facility (PAN) voor hun geweldige ondersteuning voor het filmen. Dit werk wordt gefinancierd door de JPB Foundation en Vincent J. Coates Foundation.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
- Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
- Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
- Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer’s disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
- Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), 79-89 (2018).
