डीप सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए एक वयस्क माउस ब्रेन गोलार्द्ध से क्षेत्र-विशिष्ट माइक्रोग्लिया का अलगाव
Summary
हम एक वयस्क माउस मस्तिष्क गोलार्द्ध के विभिन्न विच्छेदित क्षेत्रों से माइक्रोग्लिया के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसके बाद पूर्ण लंबाई वाले ट्रांसक्रिप्टोम के डीप सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए अर्ध-स्वचालित पुस्तकालय तैयारी की जाती है। यह विधि स्वास्थ्य और रोग में माइक्रोग्लिया की कार्यात्मक विषमता को स्पष्ट करने में मदद करेगी।
Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में निवासी मैक्रोफेज के रूप में, माइक्रोग्लिया सक्रिय रूप से मस्तिष्क के विकास और होमोस्टोसिस को नियंत्रित करते हैं, और उनके रोग मानव रोगों को चला सकते हैं। होमोस्टैटिक माइक्रोग्लिया के आणविक हस्ताक्षरों के साथ-साथ पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में उनके जीन अभिव्यक्ति के परिवर्तन को उजागर करने के लिए काफी प्रगति की गई है । एकल-कोशिका जीनोमिक पद्धतियों के आगमन और परिपक्वता के साथ, यह तेजी से मान्यता प्राप्त है कि विषम माइक्रोग्लिया विभिन्न विकासात्मक और रोग स्थितियों में खेलने वाली विविध भूमिकाओं को रेखांकित कर सकता है। इस तरह की विषमता के आगे विच्छेदन ब्याज के एक दिए गए क्षेत्र से माइक्रोग्लिया के कुशल अलगाव के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जिसके बाद व्यक्तिगत कोशिकाओं की संवेदनशील प्रोफाइलिंग की जा सकती है । यहां, हम एक वयस्क माउस मस्तिष्क गोलार्द्ध में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से माइक्रोग्लिया के तेजी से अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि प्लेट-आधारित डीप सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए इन हल माइक्रोग्लिया का उपयोग कैसे करें। हम अन्य परिदृश्यों के लिए इस विधि की अनुकूलनशीलता पर चर्चा करते हैं और बड़े पैमाने पर अध्ययनों को समायोजित करने के लिए प्रणाली में सुधार के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं।
Introduction
माइक्रोग्लिया, सभी तंत्रिका कोशिकाओं का 5%−10% का प्रतिनिधित्व करते हैं, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस)1में फैले निवासी मैक्रोफेज हैं। रक्त-मस्तिष्क बाधा के पीछे संरक्षित, स्वस्थ वयस्क मस्तिष्क में विशिष्ट माइक्रोग्लिया में कई अच्छी प्रक्रियाएं होती हैं जो पैरान्चिमा में न्यूरॉन्स और अन्य ग्लियल कोशिकाओं के साथ बातचीत करने के लिए तेजी से विस्तार और वापस ले जाती हैं। माइक्रोग्लिया विशिष्ट विकासात्मक चरणों के दौरान या चोट और रोग1,2,3,4में प्रतिरक्षा चुनौतियों से जुड़े अमोएब्इड आकृति विज्ञान को भी अपना सकता है । हाल ही में रोमांचक खोजों ने स्पष्ट रूप से दिखा दिया है कि माइक्रोग्लिया मस्तिष्क-व्युत्पन्न या रोग संकेतों के लिए निष्क्रिय पास खड़े नहीं हैं, लेकिन मस्तिष्क के विकास और होमोस्टोसिस को नियंत्रित करने में निर्णायक भूमिका निभाते हैं, उदाहरण के लिए, न्यूरोनल अस्तित्व का समर्थन करके, अपरिपक्व सिनेप्स की छंटाई, ओलिगोडेनरोसाइट वंश कोशिकाओं के भेदभाव के साथ-साथ एंजियोजेनेसिस1को बढ़ावा देना। चूंकि माइक्रोग्लिया के अधिक कार्य स्पष्ट होते हैं, उत्तेजना को मानव आनुवंशिकी अध्ययनों से अधिक ईंधन दिया जाता है, जिससे पता चला है कि ट्रेम2 जैसे कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग जोखिम वाले जीन मुख्य रूप से या विशेष रूप से माइक्रोग्लिया5,6,7द्वारा व्यक्त किए जाते हैं। विकास और प्रशंसनीय रोग ड्राइविंग भूमिकाओं में उनके महत्व को देखते हुए, हाल ही में माइक्रोग्लजीन विनियमन और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्य खोजने की आशा में समारोह की हमारी समझ की दिशा में जबरदस्त प्रयास किया गया है1,8।
आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) सेल प्रकार-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति के निष्पक्ष लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, जो बदले में वैज्ञानिकों को घने सेलुलर नेटवर्क7में जीन कार्यों की जांच करने के लिए मार्गदर्शन करता है। आरएनए-सेक ज्यादातर थोक नमूनों पर किया गया था, जिससे होमोस्टैटिक माइक्रोग्लियल जीन हस्ताक्षर की खोज हुई जो उन्हें अन्य तंत्रिका और प्रतिरक्षा कोशिकाओं9से अलग करती है। हालांकि, इस तरह के एक दृष्टिकोण माइक्रोग्लिया के बीच आणविक और कार्यात्मक मतभेदों को नजरअंदाज कर सकता है, विशेष रूप से उन क्षणिक विकास में मौजूद है, या उंर बढ़ने और रोग के साथ जुड़े । दरअसल, एकल सेल आरएनए-सीक्यू (स्क्आरएनए-सीक्यू) संवेदनशीलता और संकल्प प्रदान करता है जिसने विभिन्न संदर्भों2,3,10में माइक्रोग्लिया की पहले से कम सराहना की गई विषमता का खुलासा करके क्षेत्र में क्रांति ला दी है। इसके अलावा, सीएनएस-सर्कुलेशन इंटरफेस में अन्य समान प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण, स्क्आरएनए-सीक्यू इन संबंधित कोशिकाओं को अलग करने और कार्यात्मक रूप से कम पूर्व ज्ञान2,11के साथ अलग और कार्यात्मक रूप से विच्छेदन करने के लिए नए उपकरणों के डिजाइन में सहायता करने वाली जानकारी प्रदान करता है।
स्क्आरएनए-सीक्यू प्लेटफार्मों की एक विविध सरणी का आविष्कार किया गया है, प्रत्येक कुछ अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त12। सामान्य तौर पर, 10x जीनोमिक्स जैसे बूंद-आधारित तरीके, प्रत्येक रन में अनुक्रमित हजारों कोशिकाओं के साथ थ्रूपुट में अधिक होते हैं, और वे इनपुट के लिए कम चयनात्मक होते हैं जिसमें मिश्रित कोशिका आबादी हो सकती है जिसमें व्यापक वर्गीकरण की आवश्यकता होती है। प्लेट-आधारित विधियां उच्च संवेदनशीलता प्रदान करती हैं और गहराई13,14पढ़ती हैं, आमतौर पर सूक्ष्म मतभेदों या दुर्लभ प्रतिलिपियों को प्रकट करने के लिए सेल छंटाई से विशिष्ट आबादी को लक्षित करती हैं। सभी सीएनएस सेल प्रकारों के बीच माइक्रोग्लियल कोशिकाओं, विशेष रूप से उन विकास-या रोग से जुड़ी उपआबादी के छोटे प्रतिशत को देखते हुए, अक्सर माइक्रोग्लिया को ब्याज के एक विशिष्ट क्षेत्र से अलग करना और उनकी विषमता को समझने के लिए गहरी और पूर्ण लंबाई की प्रतिलेखन जानकारी प्राप्त करना वांछनीय होता है।
यहां, हम एक गोलार्द्ध से विच्छेदित विभिन्न माउस मस्तिष्क क्षेत्रों से माइक्रोग्लिया को अलग करने के तरीके के बारे में विवरण प्रदान करते हैं, जिनका उपयोग अर्ध-स्वचालित प्लेट-आधारित पुस्तकालय तैयार करने की प्रक्रिया के बाद एकल-कोशिका (या थोक) आरएनए-सीक्यू के लिए किया जाता है। इसके बाद दूसरे गोलार्द्ध का इस्तेमाल हिस्टोलॉजिकल सत्यापन के लिए किया जा सकता है । एक पहले प्रकाशित विधि9से सुव्यवस्थित, इस अलगाव प्रोटोकॉल शुरू सामग्री की छोटी राशि से उपज को अधिकतम करने के लिए करना है, और इस बीच एंडोजेनस माइक्रोग्लियल जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल बनाए रखने । हम 96-अच्छी प्लेटों में माइक्रोग्लिया (या अन्य संबंधित प्रतिरक्षा कोशिकाओं) को समृद्ध करने के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (एफएसीएस) का उपयोग करते हैं और थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए पुस्तकालय तैयार करने के लिए अभिकर्मकों की मात्रा को छोटा करते हैं। हम इस संवेदनशील स्क्आरएनए-सीक्यू प्लेटफॉर्म को हाइलाइट करते हैं, हालांकि अन्य प्लेट-आधारित रणनीतियों को लागू किया जा सकता है। इस विधि को आसानी से अन्य विच्छेदित ऊतकों, जैसे चोट या रोग फोसी से माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और माउस की उम्र लगभग किसी भी प्रसवोत्तर चरणों में भिन्न हो सकती है। एकल सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक्स अध्ययन के लिए क्षेत्रीय माइक्रोग्लिया के कुशल अलगाव से स्वास्थ्य और रोग में उनके कार्यों की बेहतर समझ में आसानी होगी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइक्रोग्लिया सक्रिय रूप से सीएनएस में अन्य सेल प्रकारों के साथ बातचीत करते हैं, और वे पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के प्रति बहुत संवेदनशील हैं। अलगाव की प्रक्रिया के दौरान उनके जीन अभिव्यक्ति में भड़काऊ प…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान उनकी मदद के लिए मारिको एल बेनेट, लता निकोल बोनानो और स्पायरोस डार्मैनिस को धन्यवाद देते हैं। हम स्टैनफोर्ड साझा FACS सुविधा, विशेष रूप से मेरेडिथ Weglarz और लिसा निकोल्स का भी शुक्रिया अदा करते हैं; येन ट्रान, स्टैनफोर्ड प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सुविधा (पैन) से माइकल Eckart फिल्मांकन के लिए उनके महान समर्थन के लिए । इस काम को जेपीबी फाउंडेशन और विंसेंट जे कोट्स फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
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