Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula
Summary
Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.
Abstract
Como macrófagos residentes en el sistema nervioso central, la microglia controla activamente el desarrollo cerebral y la homeostasis, y sus disfunciones pueden impulsar enfermedades humanas. Se han realizado avances considerables para descubrir las firmas moleculares de la microglia homeostática, así como las alteraciones de su expresión génica en respuesta a los estímulos ambientales. Con el advenimiento y la maduración de metodologías genómicas de una sola célula, se reconoce cada vez más que la microglia heterogénea puede subyacen a las diversas funciones que desempeñan en diferentes condiciones de desarrollo y patológicas. La disección adicional de dicha heterogeneidad puede lograrse mediante el aislamiento eficiente de la microglia de una región determinada de interés, seguido de perfiles sensibles de células individuales. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento rápido de la microglia de diferentes regiones cerebrales en un solo hemisferio cerebral de ratón adulto. También demostramos cómo utilizar estas microglia ordenadas para la secuenciación de ARN de una sola célula profunda a base de placas. Discutimos la adaptabilidad de este método a otros escenarios y proporcionamos directrices para mejorar el sistema para adaptarse a estudios a gran escala.
Introduction
Microglia, que representa el 5% al 10% de todas las células neuronales, son macrófagos residentes dispersos por todo el sistema nervioso central (SNC)1. Protegida detrás de la barrera hematoencefálica, la microglia típica en un cerebro adulto sano contiene muchos procesos finos que se extienden y se retraen rápidamente para interactuar con las neuronas y otras células gliales en el parénquima. Microglia también puede adoptar la morfología amoeboides asociada con el aumento de la función fagocítica durante etapas específicas del desarrollo o ante los desafíos inmunológicos en lesiones y enfermedades1,2,3,4. Descubrimientos emocionantes recientes han demostrado claramente que la microglia no son de ninguna manera transeúntes pasivos a señales derivadas del cerebro o patológicas, pero desempeñan un papel fundamental en el control del desarrollo cerebral y la homeostasis, por ejemplo, apoyando la supervivencia neuronal, podando sysese inmaduros, promoviendo la diferenciación de las células del linaje de oligodendrocitos, así como la angiogénesis1. A medida que se aclaran más funciones de la microglia, la excitación se alimenta aún más de estudios de genética humana, que mostraron que muchos genes de riesgo de enfermedades neurodegenerativas, como TREM2, se expresan predominante o exclusivamente por microglia5,6,7. Dada su importancia en el desarrollo y los roles plausibles de conducción de enfermedades, recientemente se ha hecho un enorme esfuerzo para nuestra comprensión de la regulación y función de los genes microgliales con la esperanza de encontrar nuevas dianas terapéuticas para las enfermedades neurodegenerativas1,8.
La secuenciación de ARN (RNA-seq) permite la caracterización imparcial de la expresión génica específica del tipo de célula, que a su vez guía a los científicos para investigar las funciones genéticas en redes celulares densas7. ARN-seq se había hecho principalmente en muestras a granel, lo que llevó al descubrimiento de una firma de genes microgliales homeostáticos que las distingue de otras células neuronales e inmunitarias9. Sin embargo, este enfoque podría pasar por alto las diferencias moleculares y funcionales entre la microglia, especialmente las presentes transitoriamente en el desarrollo, o asociadas con el envejecimiento y la enfermedad. De hecho, el ARN-seq de una sola célula (scRNA-seq) ofrece la sensibilidad y la resolución que han revolucionado el campo al revelar la heterogeneidad previamente poco apreciada de la microglia en una variedad de contextos2,3,10. Además, debido a la presencia de otras células inmunitarias similares en la interfaz de circulación del SNC, scRNA-seq proporciona información que ayuda al diseño de nuevas herramientas para separar y diseccionar funcionalmente estas células relacionadas con poco conocimiento previo2,11.
Se ha inventado una amplia gama de plataformas scRNA-seq, cada una adecuada para ciertas aplicaciones12. En general, los métodos basados en gotas, como 10x Genomics, son mayores en rendimiento con (decenas de) miles de celdas secuenciadas en cada ejecución, y son menos selectivos para la entrada que puede contener poblaciones de células mixtas que requieren una categorización amplia. Los métodos basados en placas proporcionan una mayor sensibilidad y profundidad de lectura13,14, por lo general dirigidos a poblaciones específicas de la clasificación celular para revelar diferencias sutiles o transcripciones raras. Dado el pequeño porcentaje de células microglia, en particular las subpoblaciones asociadas al desarrollo o a la enfermedad, entre todos los tipos de células del SNC, a menudo es deseable aislar la microglia de una región específica de interés y obtener información transcriptomica profunda y completa para comprender su heterogeneidad.
Aquí, proporcionamos detalles sobre cómo aislar la microglia de diferentes regiones cerebrales de ratón diseccionadas de un solo hemisferio, que se utilizan para ARN-seq de una sola célula (o a granel) siguiendo un procedimiento de preparación de biblioteca ssemi-automatizado basado en placas. El otro hemisferio se puede utilizar para la validación histológica. Simplificado a partir de un método publicado anteriormente9, este protocolo de aislamiento tiene como objetivo maximizar el rendimiento de una pequeña cantidad de materiales de partida, y mientras tanto mantener perfiles de expresión génica microglial endógenos. Utilizamos la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para enriquecer la microglia (u otras células inmunitarias relacionadas de interés) en placas de 96 pocillos y miniaturizar los volúmenes de reactivos para la preparación de la biblioteca con el fin de aumentar el rendimiento. Destacamos esta plataforma sensible scRNA-seq, aunque se pueden aplicar otras estrategias basadas en placas. Este método se puede adaptar fácilmente para aislar la microglia de otros tejidos diseccionados, como lesiones o focos de enfermedad, y la edad del ratón puede variar en casi cualquier etapa postnatal. El aislamiento eficiente de la microglia regional para estudios de transcriptomica de una sola célula facilitará una mejor comprensión de sus funciones en salud y enfermedades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia interactúa activamente con otros tipos de células en el SNC, y son muy sensibles a los estímulos ambientales. Con el fin de minimizar las respuestas inflamatorias y los cambios aberrantes en su expresión génica durante el proceso de aislamiento, este protocolo se ha simplificado a partir de un método publicado previamente9,y ahora es adecuado aislar la microglia de múltiples regiones de un solo hemisferio cerebral de ratón en paralelo. Los tejidos y reactivos se mantienen a tempe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno y Spyros Darmanis por su ayuda durante el desarrollo de este protocolo. También agradecemos el Stanford Shared FACS Facility, particularmente Meredith Weglarz y Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart de Stanford Protein y Nucleic Acid Facility (PAN) por su gran apoyo al rodaje. Este trabajo está financiado por la Fundación JPB y la Fundación Vincent J. Coates.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
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