식도 재건은 도전적인 절차이며, 식도 점막과 근육의 재생을 가능하게하고 인공 이식으로 이식 할 수있는 조직 공학 식도의 개발이 필요합니다. 여기에서는 스캐폴드 제조, 생물 반응기 재배 및 다양한 수술 기법을 포함한 인공 식도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
원주 식도 재건을 위한 생체 적합성 물질의 사용은 쥐에서 기술적으로 도전적인 작업이며 영양 지원을 지원하는 최적의 임플란트 기술이 필요합니다. 최근에는 식도 조직 공학에 많은 시도가 있었지만 연석의 특별한 환경에서 초기 상피화의 어려움으로 인해 성공률이 제한되었습니다. 여기서, 우리는 2층 관 성 비계, 중간 엽 줄기 세포 기반 생물 반응기 시스템 및 변형된 바이패스 공급 기술을 통해 식도 점막과 근육 층의 재생을 향상시킬 수 있는 인공 식도를 개발했습니다. 위장관 절제술. 스캐폴드는 외벽을 감싸는 3차원(3D) 인쇄 폴리카프롤락톤 가닥을 가진 원통형 형태의 폴리우레탄(PU) 나노섬유로 이루어진다. 이식에 앞서, 인간 유래 중간엽 줄기 세포를 스캐폴드의 내루에 파종하고, 세포 반응성을 향상시키기 위해 생물반응기 재배를 수행하였다. 우리는 외과 적 해부학을 적용하고 갑상선 플랩으로 이식 된 보철을 덮고 일시적인 비내구 위절제술 을 통해 이식 생존율을 향상시켰습니다. 이 접목은 조직학 분석에 의해 입증된 바와 같이 이식된 부위 의 주위에 초기 상피화 그리고 근육 재생의 사실 인정을 되풀이할 수 있었습니다. 또한, 엘라스틴 섬유 증가 및 혈관 신생은 이식편 주변에서 관찰되었다. 따라서,이 모델은 원주 식도 재건을위한 잠재적 인 새로운 기술을 제시한다.
서론
선천성 기형 및 식도 암과 같은 식도 장애의 치료는 식도의 구조적 세그먼트 손실로 이어질 수 있습니다. 대부분의 경우, 위 풀업 도관 또는 결장 간과 같은 자가 대체 이식편이1,2로수행되었습니다. 그러나, 이러한 식도 교체는 다양한 외과적 합병증 및 재수술 위험이3. 따라서, 네이티브 식도를 모방한 조직 공학식도 비계의 사용은 궁극적으로 손실된 조직을 재생하기 위한 유망한 대안 전략이 될 수 있다4,5,6.
조직 공학식도 잠재적으로 식도 결함의 현재 치료에 대 한 대안을 제공 하지만, 그것의 생체 내 응용 프로그램에 대 한 중요 한 장벽이 있다. 이식된 식도 비계의 수술 후 해부학 적 누설 및 괴사는 필연적으로 매질7과같은 주변 무균 공간의 치명적인 감염으로 이어질 수 있습니다. 따라서 상처 및 비위 관의 음식이나 타액 오염을 방지하는 것이 매우 중요합니다. 위장관 절제술 또는 정맥 영양은....
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프로토콜
여기에 설명된 모든 방법은 서울대학교병원의 기관동물관리및사용위원회(IACUC No. 17-0164-S1A0)의 승인을 받았습니다.
1. 비계 제조
참고 : 2 층 식도 스캐폴드는 전기 방사 및 3D 프린팅을 결합하여 제조됩니다. 관형 스캐폴드의 내부 멤브레인은 컬렉터로서 회전하는 스테인리스 스틸 만드렐로전기방사 폴리우레탄(PU)에 의해 제조되었다.
- 관형 PU 나노 섬유의 제조를 위해, 실온에서 8 시간 동안 N,N-디메틸 포름 아미드 (DMF)에서 교반하여 PU 폴리머의 20 % (w / v) 용액을 준비하십시오.
- PU 용액을 무딘 금속 바늘(22G)으로 주사기 에 놓고, 바늘 끝과 회전 수집기 사이의 30cm 거리에서 회전스테인리스 맨드릴(직경 = 2 mm)에 전기 스핀을 놓습니다.
참고: 전원 공급 장치는 15kV 전위가 되는 고전압 직전류로 설정됩니다. 용액의 공급 속도는 주사기 펌프를 사용하여 0.5 mL/h로 고정됩니다. - 3.14 m/s에서 회전 하는 맨드렐의 표면에 관 형 나노 섬유 층을 확인 합니다.
- PU 나노섬유를 진공 오븐에서 40°C에서 하룻밤 동안 건조하여....
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결과
도 1은 PU-PCL 2층 관형 스캐폴드의 제조 공정에 대한 개략적 도표를 나타낸다. 상기 PU 용액은 두께 200 μm의 원통형 내부 구조를 만들기 위해 18 G 바늘로부터 전기스펀을 하였다. 이어서, 용융된 PCL을 PU 나노섬유의 외벽에 일정한 간격으로 인쇄하였다. 완성된 관성 스캐폴드의 내벽및 외벽의 표면 형태는 주사 전자 현미경 이미지에서 볼 수 있다.
도 2는 외부 영양 공급을 위해 쥐에 위장관튜브를 삽입하는 과정을나타낸다(도 2A). T자형 실리콘 튜브를 위벽에 삽입하고 봉합하였다(도2B).
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토론
인공 식도에 기존 동물 연구는 여전히 몇 가지 중요 한 요인에 의해 제한. 이상적인 인공 식도 스캐폴드는 생체 적합성이어야하며 우수한 물리적 특성을 가져야합니다. 그것은 해부학 누설을 방지하기 위해 초기 수술 후 기간에 점막 상피를 재생할 수 있어야합니다. 내측 원형 및 외측 세로 근육층의 재생은 기능연동동동사12,13에도중요하다.
식도의 기계적 특성은 식도가 호흡 중에 붕괴되고 삼키는 동안 열리기 때문에 필수적이며, 반동현상14와최대 스트레칭에 지속적으로 노출됩니다. 이식된 스캐폴드는 이러한 기계적 특성도 가져야 합니다. 이식된 식도의 점탄성은 식도를 통해 연동 운동의 반복적 인 램프 - 이완에 적합해야합니다. 너무 약한 스캐폴드는 파열되거나 누출되어 수령인의 심각한 상태(예: 매만염)를 유발할 수 있습니다. 대조적으로, 너무 뻣뻣.......
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공개 사항
본 연구를 위해 설계된 바이오리액터 시스템이 상용화되었습니다(모델 번호: ACBF-100).
감사의 글
이 연구는 한국보건산업진흥원(KHIDI)을 통해 한국보건기술R&D 사업지원, 보건복지부(보조금 번호: HI16C0362) 및 기초과학연구 교육부의 지원을 받는 국립연구재단(NRF)을 통한 프로그램(2017R1B2011132). 이 연구에 사용된 생물표본및 데이터는 한국바이오뱅크 네트워크 회원인 서울대학교병원 바이오뱅크가 제공했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 대사 케이지 | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g 용량) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL 주사기 | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% 파라포름알데히드 | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| 항생제 겐타마이신(셉토팔). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | 시그마 | 5470 | |
| 구연산염 완충액, ph6.0, 10X | 시그마 | C9999 | |
| DAB 과산화 효소 기판 키트 | 벡터 | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| 탄성 얼룩 키트 | ScyTeK | ETS-1 | |
| 에탄올 | Merck | 100983 | |
| 에탄올 | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| 글루타르알데히드 | Sigma | 354400 | |
| 염소 안티 마우스 IgG (H+L) 2차 항체 | ThermoFisher | A-11001 | |
| 헤파린 캡 | 협성메디칼 | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / 성장 배지 (MesenPRO RSTM) | Invitrogen | R7788-110 | |
| 양고추냉이 과산화효소 접합 키트(Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| 과산화수소 | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD 생존 분석 키트 | 분자 프로브 | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-디메틸포름아미드(DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24웰 조직 배양 플레이트. | Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| 페트리 디쉬 | Eppendorf | 3072115 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| 폴리카프로락톤(PCL) 폴리머 | Sigma | 440744 | |
| 폴리 우레탄 (PU + A2 : A24) 폴리머 | Lubrizol | 2363-80AE | |
| 전원 공급 장치 | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade 시약 with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| 실리콘 T- 튜브 | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| 틸레타민/졸라제팜(Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| 트리크롬 염색 키트 | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
참고문헌
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al.
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