Inducerende post-traumatisk epilepsi i en mus model af gentagne diffuse traumatisk hjerneskade

Summary

Denne systematiske protokol beskriver en ny dyremodel af posttraumatisk epilepsi efter gentagne mild traumatisk hjerneskade. Den første del detaljer trin for traumatisk hjerneskade induktion ved hjælp af en modificeret vægttab model. Den anden del indeholder instruktioner om den kirurgiske tilgang til enkelt- og multi-kanal elektroencefalografiske dataindsamlingssystemer.

Abstract

Traumatisk hjerneskade (TBI) er en førende årsag til erhvervet epilepsi. TBI kan resultere i en brændvidde eller diffus hjerneskade. Focal skade er et resultat af direkte mekaniske kræfter, undertiden trænge gennem kraniet, hvilket skaber en direkte læsion i hjernevævet. Disse er synlige under hjernebilleddannelse som områder med kontusion, laceration, og blødning. Brændioner fremkalder neuronal død og glial ardannelse og er til stede i 20%−25% af alle mennesker, der pådrager sig en TBI. I de fleste TBI-tilfælde forårsages der imidlertid skade af accelerationsdecelerationskræfter og efterfølgende vævsklipning, hvilket resulterer i nonfocal, diffus skade. En delpopulation af TBI-patienter fortsætter med at udvikle posttraumatisk epilepsi (PTE) efter en ventetid på måneder eller år. I øjeblikket er det umuligt at forudsige, hvilke patienter der vil udvikle PTE, og anfald hos PTE-patienter udfordrer at kontrollere, hvilket kræver yderligere forskning. Indtil for nylig var feltet begrænset til kun to dyre-/gnaveremodeller med validerede spontane posttraumatiske anfald, der begge præsenterede store fokale læsioner med massive vævstab i cortex og undertiden subkortikale strukturer. I modsætning til disse tilgange blev det fastslået, at diffus TBI induceret ved hjælp af en modificeret vægttabsmodel er tilstrækkelig til at indlede udvikling af spontane krampeanfald og ikke-krampeanfald, selv i mangel af fokale læsioner eller vævstab. Svarende til menneskelige patienter med erhvervet post-traumatisk epilepsi, denne model præsenterer med en latenstid efter skade før beslaglæggelse debut. I denne protokol vil samfundet blive forsynet med en ny model for posttraumatisk epilepsi, der beskriver, hvordan man kan fremkalde diffus ikke-læsional TBI efterfulgt af kontinuerlig langsigtet video-elektroencefalografisk overvågning af dyr i løbet af flere måneder. Denne protokol vil indeholde en detaljeret håndtering af dyr, vægtfaldsproceduren, elektrodeplaceringen for to anskaffelsessystemer og de hyppige udfordringer, der er opstået under hvert af trinene i kirurgi, postoperativ overvågning og dataindsamling.

Introduction

Hvert år påvirker TBI anslået 60 millioner mennesker på verdensplan. Påvirket individer har højere risiko for at udvikle epilepsi, som kan manifestere år efter den første skade. Selv om svær TBI er forbundet med en højere risiko for epilepsi, selv mild TBI øger en persons chance for at udvikle epilepsi^1,2,3,4. Alle TBI’er kan klassificeres som fokale, diffuse eller en kombination af begge. Diffus hjerneskade, til stede i mange, hvis ikke alle TBI’er, er et resultat af hjernevæv af forskellige tætheder klipning mod hinanden på grund af acceleration-deceleration og roterende kræfter. Pr. definition forekommer diffus skade kun isoleret i mild/concussive ikke-gennemtrængende hjerneskade, hvor der ikke er synlige hjernelæsioner på computertomografiscanninger⁵.

Der er i øjeblikket to kritiske problemer i forvaltningen af patienter, der har eller er i risiko for at udvikle posttraumatisk epilepsi (PTE). Den første er, at når PTE har manifesteret, anfald er resistente over for tilgængelige anti-epileptiske lægemidler (AED’ er)⁶. For det andet er AED’er lige så ineffektive til at forebygge epileptogenese, og der findes ingen effektive alternative terapeutiske tilgange. For at afhjælpe dette underskud og finde bedre terapeutiske mål og kandidater til behandling, vil det være nødvendigt at udforske nye cellulære og molekylære mekanismer i roden af PTE⁶.

Et af de fremtrædende træk ved post-traumatisk epilepsi er den latente periode mellem den oprindelige traumatiske begivenhed og udbrud af spontane, uprovokerede, tilbagevendende anfald. De hændelser, der opstår i dette tidsmæssige vindue er et naturligt fokus for forskere, fordi denne tid vindue kan tillade behandling og forebyggelse af PTE helt. Dyremodeller er mest almindeligt anvendt til denne forskning, fordi de tilbyder flere forskellige fordele, ikke mindst som er, at løbende overvågning af menneskelige patienter ville være både upraktisk og dyrt over sådanne potentielt lange perioder. Derudover kan cellulære og molekylære mekanismer ved roden af epileptogenese kun udforskes i dyremodeller.

Dyremodeller med spontane posttraumatiske anfald og epilepsi foretrækkes frem for modeller, hvor anfald fremkaldes efter TBI med mindre fysiologisk relevante midler, såsom ved chemoconvulsants eller elektrisk stimulation akut, kronisk eller ved optænding. Spontane post-traumatiske beslaglæggelse modeller teste, hvordan TBI ændrer den sunde hjerne netværk, der fører til epileptogenese. Undersøgelser, der anvender yderligere stimulation efter TBI, vurderer, hvordan eksponering for TBI reducerer krampetærsklen og påvirker modtagelighed for anfald. Fordelene ved dyremodeller med anfald, der er induceret kemisk eller med elektrisk stimulation, er ved at teste de specifikke mekanismer for refractoriness til AED’er og effekten af eksisterende og nye AED’er. Men graden af relevans og oversættelse af disse data til mennesker kan være tvetydig^{e 7} på grund af følgende: 1) krampemekanismer kan være forskellig fra dem, der frembringes af TBI alene; 2) ikke alle disse modeller fører til spontane anfald^7; 3) læsioner skabt af krampemiddel selv, med kanyle, der kræves for dens levering, eller ved at stimulere elektrode placering i dybden strukturer (f.eks hippocampus eller amygdala) kan allerede forårsage øget beslaglæggelse modtagelighed og endda hippocampal epileptiform felt potentialer⁷. Desuden producerer nogle krampefulde stoffer (dvs. kainicsyre) direkte hippocampale læsioner og sklerose, hvilket ikke er typisk efter diffus TBI.

Indtil for nylig eksisterede der kun to dyremodeller af posttraumatisk epilepsi: kontrolleret kortikal påvirkning (CCI, fokal) eller væskeslagskade (FPI, fokal og diffus)⁸. Begge modeller resultere i store fokale læsioner sammen med vævstab, blødning, og gliose hos gnavere⁸. Disse modeller efterligner posttraumatisk epilepsi induceret af store fokale læsioner. En nylig undersøgelse viste, at gentagne (3x) diffus TBI er tilstrækkelig til udvikling af spontane anfald og epilepsi hos mus, selv i mangel af fokale læsioner⁹, tilføje en tredje gnaver PTE model med bekræftede spontane tilbagevendende anfald. Denne nye model efterligner cellulære og molekylære ændringer fremkaldt af diffus TBI, bedre repræsenterer den menneskelige befolkning med mild, concussive TBI’er. I denne model, den latente periode på tre uger eller mere før beslaglæggelse debut og fremkomsten af sene, spontane, tilbagevendende anfald giver mulighed for at undersøge de grundlæggende årsager til post-traumatisk epileptogenese, teste effekten af forebyggende tilgange og nye terapeutiske kandidater efter beslaglæggelse debut, og har potentiale for udvikling af biomarkører af post-traumatisk epileptogenese fordi omkring halvdelen af dyrene udvikler post-traumatisk epilepsi.

Valget af dyremodel til undersøgelse af posttraumatisk epilepsi afhænger af det videnskabelige spørgsmål, den type hjerneskade, der undersøges, og hvilke værktøjer der vil blive brugt til at bestemme de underliggende cellulære og molekylære mekanismer. I sidste ende skal enhver model af posttraumatisk epilepsi påvise både fremkomsten af spontane anfald efter TBI og en indledende latenstid i en delmængde af TBI-dyr, fordi ikke alle patienter, der pådrager sig en TBI, fortsætter med at udvikle epilepsi. For at gøre dette, elektroencefalografi (EEG) med samtidig video erhvervelse bruges i denne protokol. Det er afgørende for nøjagtig datafortolkning at forstå de tekniske aspekter bag hardware og tilgange til dataindsamling. De kritiske hardware aspekter omfatter den type optagelse system, type elektroder (skrue eller wire bly) og materiale, de er lavet af, synkroniseret video erhvervelse (som en del af EEG-systemet eller tredjepart), og egenskaber af edb-systemet. Det er bydende nødvendigt at fastsætte de relevante anskaffelsesparametre i enhver type system afhængigt af undersøgelsesmål, EEG-hændelser af interesse, yderligere analysemetode og datalagringens bæredygtighed. Endelig skal metoden til elektrodekonfiguration (montage) overvejes, da de hver især har fordele og ulemper og vil påvirke datafortolkningen.

Denne protokol beskriver, hvordan man bruger den modificerede Marmarou vægttab model^10,11 til at fremkalde diffus skade resulterer i spontane, uprovokerede, tilbagevendende anfald i mus, beskriver kirurgiske tilgange til at erhverve en enkelt- og multi-kanal kontinuerlig, og synkroniseret video EEG ved hjælp af monopolar, bipolar, eller blandet montage.

Protocol

Alle de dyreprocedurer, der er beskrevet i denne protokol, blev udført i overensstemmelse med Virginia Techs institutionelle komité for dyrepleje og -anvendelse (IACUC) og i overensstemmelse med National Institutes of Healths »Vejledning til pleje og anvendelse af laboratoriedyr« . 1. Protokol om håndtering af dyr BEMÆRK: Denne protokol har til formål at vænne dyr, der er bestilt fra en leverandør til anlægget efter ankomsten, og at betingelse dem om at bliv…

Representative Results

Den protokol, der er skitseret her, beskriver metoden til induktion af en diffus skade isoleret (f.eks. i mangel af en fostlæsion) ved hjælp af en musemodel af gentagne diffuse TBI (Figur 1). Figur 1A viser vægtdråbeanordningen og dens komponenter ( figur1A, a1−a5), der anvendes til induktion af TBI i denne model, og afgørende trin under proceduren (figur 1<stron…

Discussion

I modsætning til CCI- og FPI-modeller, der inducerer enten fokal eller kombination af fokale og diffuse skader, giver modellen for gentagne diffuse TBI, der er beskrevet i denne protokol, mulighed for induktion af diffus skade i mangel af fokal hjerneskade og kræver ikke hovedbunds- eller kranieåbninger og den tilhørende inflammation. En ekstra fordel ved fraværet af kraniektomi i denne model er, at det gør det muligt at ikke kun implantere elektroder til kronisk kontinuerlig EEG optagelse, men også oprettelsen af…

Materials

0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB