反復性びまん性外傷性脳損傷のマウスモデルにおける心的外傷後てんかんの誘導
Summary
この体系的なプロトコルは、反復的な軽度の外傷性脳損傷後の心的外傷後てんかんの新しい動物モデルを記述する。最初の部分は、変更された体重減少モデルを使用して外傷性脳損傷誘導のためのステップを詳述する。第2部では、単一および多チャンネルの脳波データ集録システムの外科的アプローチについて説明します。
Abstract
外傷性脳損傷(TBI)は、後天性てんかんの主な原因である。TBI は、焦点またはびまん性脳損傷を引き起こす可能性があります。焦点損傷は、時には頭蓋骨を貫通する直接的な機械的力の結果であり、脳組織に直接病変を引き起こした。これらは、脳イメージング中に、連続、裂傷、出血を伴う領域として見られます。焦点病変は神経死およびグリア瘢痕形成を誘発し、TBIを発生させる全ての人々の20%−25%に存在する。しかし、TBIの大部分の場合、傷害は加速減速力とその後の組織剪断によって引き起こされ、非焦点的、拡散性損傷をもたらす。TBI患者の亜集団は、数ヶ月または数年の待ち時間の後に心的外傷後てんかん(PTE)を発症し続けている。現在、どの患者がPTEを発症するかを予測することは不可能であり、PTE患者の発作は制御に困難であり、さらなる研究が必要です。最近まで、この分野は、検証された自発的な心的外傷後発作を有する2つの動物/げっ歯類モデルに限定され、両方とも皮質および時には皮質下構造における大規模な組織喪失を有する大きな焦点病変を呈した。これらのアプローチとは対照的に、変性体重減少モデルを用いて誘導されたびまん性TBIは、焦点性病変または組織喪失がない場合でも、自発的痙攣性および非けいれん発作の発症を開始するのに十分であると判断された。後天性心的外傷後てんかんを有するヒト患者と同様に、このモデルは発作発症前の傷害後の待ち時間を呈する。このプロトコルでは、コミュニティに心的外傷後てんかんの新しいモデルが提供され、数ヶ月の間に拡散性非病変TBIを誘導し、続いて数ヶ月にわたって継続的な長期的なビデオ脳波動物モニタリングを誘導する方法を詳述する。このプロトコルは、動物の取り扱い、重量低下手順、2つの集録システムの電極配置、および手術、術後モニタリング、およびデータ取得の各ステップで頻繁に遭遇する課題について詳述します。
Introduction
TBIは毎年、世界中で推定6,000万人に影響を与えています。影響を受けた個人はてんかんを発症するリスクが高く、最初の怪我の数年後に現れる可能性があります。重篤なTBIはてんかんのリスクが高いと関連していますが、軽度のTBIでさえ、てんかん1、2、3、4を発症する可能性が高くなります。すべての TBE は、フォーカル、ディフューズ、またはその両方の組み合わせに分類できます。びまん性脳損傷は、多くのTbIではないにしても多くの中に存在し、加速減速および回転力のために互いに異なる密度の脳組織の結果である。定義上、びまん性傷害は軽度/脳震盪性非貫通性脳損傷において孤立してしか起こらず、コンピュータ断層撮影スキャン5では脳病変は見えない。
現在、心的外傷後てんかん(PTE)を発症している患者の管理には2つの重大な問題があります。1つ目は、PTEが現れると、発作は利用可能な抗てんかん薬(AED)6に耐性があることです。第二に、AEはてんかんの予防に等しく効果がなく、効果的な代替治療アプローチはありません。この赤字に対処し、より良い治療標的と治療の候補を見つけるためには、PTE6の根本にある新しい細胞および分子メカニズムを探求する必要があります。
心的外傷後てんかんの顕著な特徴の1つは、最初の外傷性事象と自発的で挑発的な再発発作の発症との間の潜伏期間である。この時間枠はPTEの治療と予防を完全に可能にする可能性があるため、この時間ウィンドウ内で発生するイベントは、研究者にとって自然な焦点です。動物モデルは、いくつかの明確な利点を提供するため、この研究に最も一般的に使用されています, 少なくとも、人間の患者の継続的な監視は、このような潜在的に長い時間をかけて非現実的かつ高価であろうということです.さらに、てんかんの根本にある細胞および分子のメカニズムは、動物モデルでのみ探索することができます。
自発的な心的外傷後発作およびてんかんを有する動物モデルは、ケモコンブチル剤または電気刺激などによってTBIの後に発作が誘発されるモデルよりも好ましい。例えば、ケモコンブルサンスまたは電気刺激によって、急性、慢性、または親切によって。自発的な心的外傷後発作モデルは、TBIがてんかんを引き起こす健康な脳ネットワークをどのように変更するかをテストする。TBI後の追加刺激を用いた研究は、TBIへの暴露が発作閾値を減少させ、発作に対する感受性に影響を与える方法を評価する。化学的または電気刺激によって誘発された発作を伴う動物モデルの利点は、AEDに対する屈折性の特定のメカニズムと既存および新規のAEDの有効性をテストすることである。しかし、これらのデータのヒトへの関連性および翻訳の程度は、以下の理由で7があいまいであり得る:1)発作機構はTBI単独で誘発されるものとは異なり得る。2)これらのモデルのすべてが自発的な発作につながるわけではありません7;3)痙攣剤自体によって生じる病変は、その送達に必要なカニューレを有する、または深層構造(例えば、海馬または扁桃体)での電極配置を刺激することによって、すでに発作感受性の増加を引き起こし得る可能性があり、さらには海馬てんかん場電位7。さらに、いくつかの痙攣剤(すなわち、カイエン酸)は、直接海馬病変および硬化性を産生し、これは拡散TBI後に典型的ではない。
最近まで、心的外傷後てんかんの2つの動物モデルのみが存在していた:制御された皮質衝撃(CCI、焦点)または流体打楽器損傷(FPI、焦点およびびまん性)8。両方のモデルは、げっ歯類8の組織損失、出血、およびグリオシスと並んで大きな焦点病変をもたらす。これらのモデルは、大きな焦点病変によって誘発される心的外傷後てんかんを模倣する。最近の研究では、繰り返し(3x)びまん性TBIが、マウスに対する自発的発作およびてんかんの発症に十分であることを示した9は、自発再発性発作が確認された第3のげっ歯類PTEモデルを加える。この新しいモデルは、拡散TBIによって引き起こされる細胞および分子の変化を模倣し、軽度の脳震盪性TBIを有するヒト集団をよりよく表す。このモデルでは、発作発症前3週間以上の潜伏期間と後期の自発的な再発発作の出現は、心的外傷後てんかん発生の根本的な原因を調査し、発作発症後の予防アプローチおよび新しい治療候補の有効性をテストすることを可能にし、約半数の動物が心的外傷後てんかんを発症するため、心的外傷後てんかんのバイオマーカーの発症の可能性を有する。
心的外傷後てんかんの研究のための動物モデルの選択は、科学的な質問、調査された脳損傷の種類、および基礎となる細胞および分子メカニズムを決定するためにどのようなツールを使用するかに依存する。最終的には、心的外傷後てんかんのモデルは、TBI後の自発的発作の出現とTBI動物のサブセットにおける初期遅延期間の両方を実証しなければならない。これを行うために、このプロトコルでは、同時ビデオ集録を伴う脳波(EEG)が使用されます。データ収集ハードウェアとアプローチの背後にある技術的側面を理解することは、正確なデータ解釈のために重要です。重要なハードウェアの側面には、記録システムの種類、電極の種類(ねじまたはワイヤリード)と材料、同期ビデオ集録(EEGシステムまたはサードパーティの一部として)、およびコンピュータシステムの特性が含まれます。研究目標、対象のEEGイベント、さらなる分析方法、データストレージの持続可能性に応じて、あらゆるタイプのシステムに適切な取得パラメータを設定することが不可欠です。最後に、電極構成(モンタージュ)の方法は、それぞれ長所と短所があり、データ解釈に影響を与えるので、考慮する必要があります。
このプロトコルは、変更されたMarmarou重量降下モデル10、11を使用して、マウスにおける自発的、挑発されない再発性発作をもたらすびまん性傷害を誘発する方法を詳述し、単一および多チャンネル連続、および単一級、バイポーラ、または混合モンタージュを使用してビデオEEGを同期させる外科的アプローチを記述する。
Protocol
Representative Results
Discussion
焦点と拡散傷害のどちらを誘発するCCIおよびFPIモデルとは対照的に、このプロトコルで説明されている反復的な拡散TBIのモデルは、焦点脳損傷の不在時にびまん性傷害の誘発を可能にし、頭皮または頭蓋の開口部および関連する炎症を必要としない。このモデルにおける難解切除がないことの付加的な利点は、慢性的な連続脳波記録のための電極を埋め込むだけでなく、ShandraとRobel 20191に記?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、賞No.の下で心理的健康と外傷性脳損傷研究プログラムを通じて、米国陸軍医学研究とマテリエル司令部(DoD)から受け取った助成金CUREに基づいて、R01 NS105807/ NS /NINDS NIH HHS / 米国とCUREによってサポートされました。W81XWH-15-2-0069.イワン・ザイトフックは、原稿を校正するために非常に高く評価されています。
Materials
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8209 | 0.10 inch long stainless steel |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8403 | 0.10 inch long with pre-soldered wire lead |
| 0.12" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8212 | 0.12 inch long stainless steel |
| 1EEG headmount | Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA | MS333/8-A/SPC | 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal |
| 2EEG/1EMG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8201 | 2EEG/1EMG channels |
| 3% hydrogen peroxide | Pharmacy | ||
| 3EEG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8235-SM-C | custom 6-Pin Connector for 3EEG channels |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| C57BL/6 mice | Harlan/Envigo Laboratories Inc | male, 12-16 weeks old | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | male, 12-16 weeks old | |
| Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day |
| Chlorhexidine antiseptic | Pharmacy | ||
| Dental cement and solvent kit | Stoelting Co., USA | 51459 | |
| Drill | Foredom | HP4-917 | |
| Drill bit | Meisinger USA, LLC, USA | HM1-005-HP | 0.5 mm, Round, 1/4, Steel |
| Dry sterilizer | Cellpoint Scientific, USA | Germinator 500 | |
| EEG System 1 | Biopac Systems, CA, USA | ||
| EEG System 2 | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | ||
| Ethanol ≥70% | VWR, USA | 71001-652 | KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof) |
| Eye ointment | Pro Labs Ltd, USA | Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies | |
| Fluriso liquid for inhalation anesthesia | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Hair removal product | Church & Dwight Co., Inc., USA | Nair cream | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Povidone-iodine surgical solution | Purdue Products, USA | 004677 | Betadine |
| Rimadyl/Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | |
| Solder | Harware store | ||
| Soldering iron | Weller, USA | WP35 | ST7 tip, 0.8mm |
| Stainless steel disc | Custom made | ||
| Sterile cotton swabs | |||
| Sterile gauze pads | Fisher Scientific, USA | 22362178 | |
| Sterile poly-lined absorbent towels pads | Cardinal Health, USA | 3520 | |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, USA | 1469SB |
References
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